1、台秤      台秤用于精度不高的称量，一般只能称准到0.1g。称量前，首先调节托盘下面的螺旋，让指针在刻度板中心附近等距离摆动，此谓调零点。称量时，左盘放称量物，右盘放砝码（10g或5g以下是通过移动游码添加的），增减砝码，使指针也在刻度板中心附近摆动。砝码的总质量就是称量物的质量。称量时应注意：      1）不能称量热的物体；      2）称量物不能直接放在托盘上，依情况将其放在纸上，表面皿中或容器内；      3）称量完毕，一切复原。 2、光电天平      光电天平叫光学天平。分为双盘和单盘两种，下述为双盘光电天平。它最大载重量为200g，可以精确称量到0.1mg。      1）光电天平的构造见图。（略）      ①天平梁：是天平的主要部件之一，天平梁上有两个向上的玛瑙刀口，用来悬挂托盘。玛瑙刀口是天平很重要的部件，刀口的好坏直接影响到称量的精确程度。      ②指针：固定在天平梁的中央，天平梁摆动时，指针随着摆动，从光幕上可以读出指针摆动的位置。      ③升降钮：是控制天平工作状态和休止状态的旋钮。      ④光幕：通过光电系统使指针下端的标尺放大后，在光幕上可以清楚地读出标尺的刻度。标尺的刻度代表质量，每一大格代表1mg，每一小格代表0.1mg，（10-4g）。      ⑤天平盘和天平橱罩：天平左右有两个托盘，左盘放称量物体，右盘放砝码。光电天平是比较精密的仪器，外界条件的变化如空气流动等容易影响天平的称量，为减少这些影响，称量时一定要把橱罩的门关好。      ⑥砝码与环码：光电天平有砝码和环码。砝码装在盒内，最大质量为100g，最小质量为1g。在1g以下的是用金属丝做成的环码，安放在光电天平的右上角，加减的方法是用机械加码旋钮来控制，用它可以加10～990mg的质量。10mg以下的质量可直接在光幕上读出。      2）光电天平使用规则      ①未休止的天平不允许进行任何操作，如加减砝码，环码和物体等。      ②切勿用手直接接触光电天平的部件，取砝码一定要用镊子夹取。使用机械加码旋钮时，一定要轻轻地逐格扭动，以免损坏机械加码装置和使环码掉落！      ③不能在天平上称量热的或具有腐蚀性的物品。不能在金属托盘上直接称量药品。      ④称量时，不可超过天平所允许的最大载重量（200g）。      ⑤每次称量结束后，认真检查天平是否休止，砝码是否齐全地放入盒内，机械加码旋钮是否恢复到零的位置。全部称量完毕后关好天平橱罩，切断电源，把凳子放回天平桌子下面，把天平室整理好。      ⑥不得任意移动天平位置。如发现天平有不正常情况或在称量过程中发生了故障，要报告教师。      3）光电天平的使用方法      ①直接称量法      使用天平要认真、仔细，否则容易出错，使称量不准确，或者损坏天平。      称量前应先检查天平，如环码是否跳落，机械加码旋钮是否在零的位置等。      零点的测定：接通电源，轻轻转动升降钮，启动天平，此时灯泡发亮，光幕上可以看到标尺的投影在移动，当投影稳定后，若刻线和标尺上的零恰好重合，此时零点等于零，零点即天平不载重时的平衡点。若空载时天平的平衡点不在零，可以通过调屏拉杆，移动光屏的位置，使刻线与标尺的零线重合。也可以记下读数，此读数也是天平零点。+0.4即为零点的位置（此时零点不在零）。      测得零点后，把升降钮降下；使天平休止。      停点的测定：在称量物体前，可先在台秤上粗称一下物体的质量，以便称量时加放合适的砝码；当标尺往正数方向移动，要加砝码。      把物体放在天平左盘中心（为防止托盘晃动，应该尽可能把物体或砝码放在托盘中心）。在右盘上加放合适的砝码，随后轻轻转动升降钮，观察光幕中标尺移动的方向。若标尺迅速往负数方向移动（即刻线所指数值减小）。则表示砝码太重，要减砝码；当标尺往正数方向移动，要加砝码。      当所要加的砝码在克以下时，关紧天平侧门，用同样方法加减环码，直到刻线与标尺上某一读数相重合为止（此读数最好在-5到+5之间）。记下读数，即停点，亦即天平载重时的平衡点。      称量后，使天平休止，记下砝码和环码质量。      使用光电天平称量物体时一般均称量两次，操作方法如下：      零点测量：第一次测量休止后，再起动，测量，此为第二次，称量两次误差应小于0.2mg，即|e＇0-e″0|≤0.2。停点测量：同上。      数据记录和计算：      零点用e0表示。第一次e＇0=_____，第二次e″0=______，平均值e0=______。      停点用e1表示。第一次e＇1=______，第二次e″1=______，平均值e1=______。      物体质量（g）=砝码质量+环码质量+（停点e1-零点e0）/1000。      称量计算举例：      天平零点e0=+0.7（mg）      天平停点e1=-1.8（mg）      砝码质量：10g+2g+1g=13g      环码质量：810mg=0.810g      物体质量=13g+0.810g+（-0.0018-0.0007）g=13.8075g      ②减量法      此法用于称固体粉末状物质。将适量试样装入称量瓶中。称量瓶是带有磨口塞的小玻璃瓶，它的优点在于质量较小，可直接在天平上称量，并有磨口玻璃塞，以防止试样吸收空气中的水分等。      称量步骤如下：先准确称出称量瓶和试样的总量W1，然后取出称量瓶（用纸条裹着），放在容器的上方。将称量瓶倾斜，用称量瓶盖轻敲瓶口上部，使试样慢慢落入容器中，当倾出的试样已接近所需要的质量时将瓶竖起，再用称量瓶盖轻敲瓶口上部，使粘在瓶口的试样落下，然后盖好瓶盖。将称量瓶放回天平盘上，称量质量为W2。两次质量之差（W1-W2）就是试样的质量。这种称量方法叫减量法。按上法依次进行，可称取多份试样。若从称量瓶中倒出的药品太多，不能再倒回称量瓶中，要重新称量。     3、电子分析天平     电子分析天平为较先进的称量仪器，此类天平操作简便。将天平开启，调零后，可将被称物放于天平称量盘上，其质量从天平面板的屏幕上显示出来。这类天平还可与计算机相连接进行数据处理，可方便地获得高精度的称量结果。

配方一 各种动物需用的生理盐水哺乳类 需用生理盐水浓度是 0.9% 。称取 0.9 克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到 100 毫升。鸟类 需用的生理盐水浓度是 0.75% 。称取 0.75 克氯化钠，溶解后用蒸馏水稀释到 100 毫升。两栖类 需用的生理盐水浓度是 0.65% 。称取 0.65 克氯化钠，溶解后用蒸馏水稀释到 100 毫升。配方二 任氏（ Ringer’s ）生理盐水氯化钠 6.5 克 碳酸氢钠 0.2 克lv化钾 0.14 克 磷酸二氢钠 0.01 克氯化钙 0.12 克先把氯化钠、lv化钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠分别溶解在少量蒸馏水中，混合后用蒸馏水稀释到 980 毫升。然后取氯化钙溶解在 20 毫升蒸馏水中，把氯化钙溶液逐滴加入到上述溶液内，边滴、边搅拌，以免产生不溶解的磷酸钙沉淀。此溶液用于变温动物，尤其常用于两栖类。配方三 乐氏（ Locke’s ）生理盐水氯化钠 9.0 克 碳酸氢钠 0.1 ～ 0.3 克lv化钾 0.42 克 氯化钙 0.24 克把氯化钠、lv化钾、碳酸氢钠分别用少量蒸馏水溶解，混合后加蒸馏水到 980 毫升。把氯化钙溶解在 20 毫升蒸馏水里，逐滴加入上述溶液中。以上溶液用于恒温动物，尤其常用于哺乳类。

细胞转染是指将外源分子如 DNA RNA 等导入真核细胞的技术。可分为瞬时转染，稳定转染等。瞬时转染是指外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染后 24-72 h 内分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。稳定转染是指外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小，通常需要一些选择性标记反复筛选得到稳定转染的同源细胞系。主要有下面几种方法：化学法：磷酸钙法、DEAE-右旋糖苷法、阳离子脂质体法；物理法：电穿孔法、显微注射法、biolistic 颗粒传递法；病毒介导法：逆转录病毒、腺病毒A. 阳离子脂质体法：带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。过程如下图：特点：简单通用，适用性广，转染效率高，重复性好，但转染时需除血清，转染效率随细胞类型变化大。由于脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会远大于悬浮细胞，所以贴壁比悬浮转染效率要高。悬浮细胞建议使用电穿孔法。B. 电穿孔法：利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进入的微孔。C. 逆转录病毒（RNA）：通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用进入宿主细胞，之后反转录酶启动合成 DNA 并随机整合到宿主基因组中。特点：稳定转染，可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等，但携带基因不能太大。D. 腺病毒（双链 DNA）：先和细胞表面的受体结合，继而在αV 整合素介导下被细胞内吞。特点：可用于难转染的细胞。影响转染的因素：血清 血清影响复合物的形成，降低转染效率阳离子脂质体和 DNA 的最佳量在使用血清时会有所不同，因此想在转染培养基中加入血清时要进行条件优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康，对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用 OPTI-MEM I 培养基。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用 LIPOFECTAMINE 2000。抗生素比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。细胞代数转染前细胞最好经过 1-2 次传代保证细胞生长旺盛容易转染，注意贴壁细胞一旦长满就不好转染。细胞铺板密度一般转染时，贴壁细胞密度为 70%-90%，悬浮细胞密度为 2*10^6--4*10^6 细胞/ml 时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。DNA 质量DNA 质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术基于电荷吸引原理，如果 DNA 不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显着影响转染复合物的有效形成和转染的进行。

1. 问题： RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物。可能原因：1 ） RNA 被降解 ( 如何确定 RNA 是否被讲解，详见前 “ 植物 RNA 的提取 ” 。建议解决方法：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析  RNA 使用良好的无污染技术分离 RNA ；在将组织从动物体取出后立刻处理在 100 ％甲酰胺中储存 RNA ；如果使用胎盘 RNase  抑制剂，不要加热超过 45 ℃ 或 pH 超过 8.0 ，否则抑制剂或释放所有结合的 RNase 。而且，在 ≥0.8mM DTT 时加入  RNase 抑制剂，一定要存在 DTT 。2 ） RNA 中包含逆转录抑制剂建议解决方法：通过乙醇沉淀 RNA 除去抑制剂。用 70 ％（ v/v ）乙醇对 RNA 沉淀进行清洗。可以加入糖元（ 0.25μg 到 0.4μg/μl ）以帮助小量样品 RNA 的恢复。逆转录抑制剂包括： SDS ， EDTA ，甘油，焦磷酸钠， spermidine ，甲酰胺和胍盐。将对照 RNA 同样品混合，同对照 RNA 反应比较产量以检验抑制剂。3 ）多糖同 RNA 共沉淀建议解决方法：使用氯化锂沉淀 RNA 以除去多糖。 自己的实验经验： 一般用乙酸钠就可以出去多糖，但是要用 70 ％乙醇洗 2-3 次除盐。4 ）用于合成 cDNA 第1链合成的引物没有很好退火建议解决方法：确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在 25 ℃ 保温 10 分钟。对于基因特异性引物（ GSP ），可以试一下其他 GSP ，或换用 oligo(dT) 或随机六聚体 . 确定 GSP 是反义序列。5 ）起始 RNA 量不够建议解决方法：增加 RNA 量。对于＜ 50ng 的 RNA 样品，可以在第1链 cDNA 合成中使用 0.1μg 到 0.5μg 乙酰 BSA 。6 ） RNA 模板二级结构太多建议解决方法：将 RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性 / 退火 . 提高逆转录反应温度，对 SuperScript Ⅱ 可以到 50 ℃ ，对 ThermoScript 可以到 65 ℃ 。注意：不要在＞ 60 ℃ 时使用 oligo(dT) 引物，选择一个在反应温度可以退火的 GSP 。对于＞ 1kb 的 RT-PCR 产物，保持反应温度 ≤65℃ 。注意：不要在高于 37 ℃ 时使用 M-MLV 。如果不需要全长 cDNA ，在第1链反应中使用随机引物。7 ）引物或模板对残余的 RNA 模板敏感建议解决方法：在 PCR 前用 RNaseH 处理。8 ）靶序列在分析的组织中不表达建议解决方法：尝试其他靶序列或组织9 ） PCR 没有起作用建议解决方法：对两步法 RT-PCR ，不要在 PCR 步骤中使用超过 1/5 的逆转录反应产物。2. 问题： PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物。可能原因：1 ） PCR 引物设计较差建议解决方法：避免在引物 3' 端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计 Tm 类似的引物。2 ） DNA 含有抑制剂建议解决方法：诸如 DMSO ， SDS 和甲酰胺之类的试剂会抑制 Taq DNA 聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀 DNA 。3 ）富含 GC 的模板建议解决方法：对于 GC 含量＞ 50 ％的模板，使用 PCRx Enhancer Solution 。4 ）模板浓度太低建议解决方法：使用 104 拷贝的靶序列，以在 25 到 30 个循环中获得信号。5 ）镁离子浓度太低建议解决方法：从 1mM 到 3mM ，间隔 0.5mM 进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最jia镁离子浓度。注意：对实时定量 PCR ，使用 3mM 到 5mM 的镁离子浓度。6 ）退火温度太高建议解决方法：使用表 4 的公式估算 Tm ，把退火温度设定为低于 Tm 5℃ 。因为这些公式只是估算 Tm 值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。7 ）引物浓度太低建议解决方法：最jia引物浓度介于 0.1μM 到 0.5μM 之间。为了精que确定引物浓度，在 260nm 测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。3. 问题： RT-PCR 特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。可能原因：1 ）物和模板非特异性退火建议解决方法：在第1链合成中使用 GSP ，而不是随机引物或 oligo(dT) 。试用允许高温 cDNA 合成的 GSP 。2 ） GSP 设计较差建议解决方法：遵循用于扩增引物设计的同样原则3 ） RNA 中沾染了基因组 DNA 建议解决方法：使用扩增级 DNase Ⅰ 处理 RNA 。使用没有逆转录的对照反应检测 DNA 污染。4. 问题： PCR 特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。可能原因：1 ）形成引物二聚体建议解决方法：设计在 3' 端没有互补序列的引物。2 ）引物和模板非特异性退火建议解决方法：以 2 ℃ 到 5 ℃ 间隔增加退火温度，减少退火时间。在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。使用 Platinum Taq DNA 进行自动热启动 PCR 。避免在引物 3' 端含有 2 到 3 个 dG 或 dC 。3 ）镁离子浓度太高建议解决方法：对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。4 ）因为扩增复杂模板导致引物错误起始建议解决方法：使用巢式 PCR 或递减 PCR 。5 ）沾染外源 DNA 建议解决方法：使用抗气雾剂的 tip 和 UDG 。6 ）因为二级结构导致引物结合位点无法接近建议解决方法：对于 GC 含量＞ 50 ％的模板，使用（ 1×-3× ） PCRx Enhancer Solution 。5. 问题： PCR 忠实性： PCR 在产物序列中引入了错误可能原因：1 ）聚合酶忠实性低建议解决方法：使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如 Platinum Pfx DNA 聚合酶。2 ）循环数太多建议解决方法：降低循环数。3 ）四种 dNTP 的浓度不同建议解决方法：制备新的 dNTP 混合物，保-证四种核苷浓度相同。使用预混合物

微生物实验室最少不了的实验仪器之一就是灭菌器，一般实验室常用的是高压蒸汽灭菌器。GB 4789.1-2016中要求：实验设备应定期进行检查和/或检定（加贴标志）、维护和保养，以确保工作性能和操作安全。但你的灭菌器有没有类似的检查呢？如果要做类似的验证，又需要怎么做呢？今天就给大家汇总一下高压蒸汽灭菌器灭菌效果验证的相关内容。高压蒸汽灭菌器灭菌效果验证一般有化学指示剂法、留点温度计法、自制测温管法和生物指示剂法，每种方法的原理都是相似的，主要是通过验证灭菌时灭菌器里的温度能否达到要求。我们可以根据自己实验室的具体情况选择其中一种或多种方法进行验证。一、化学指示剂法原理：化学指示剂在一定温度与作用时间下，会受热变色或变形，根据这一特点来判断是否达到需要的灭菌参数。一般实验室常用的是3M压力灭菌指示胶带，这种指示胶带是利用灭菌前后胶带颜色变化来判断灭菌效果。它是由热敏化学物质与显色剂及漆辅料制成油墨，并将油墨以条纹状印制在特制的一面胶纸带制成。指示胶带可以直接粘贴于包裹外，长度不低于5cm，并轻压胶带以增加粘性和封包效果；在121℃持续20min或130℃持续4min后，胶带上印有的斜行的白色指示线条会完全变黑，成为黑色线条；如变色不均匀或不彻底，可认为该包裹不符合灭菌条件。二、留点温度计法原理：留点温度计法是利用水银温度计不回流的特性，其原理跟传统体温计相似，可以指示灭菌器在灭菌过程中达到的最高温度。验证时把水银温度计放在盛水的大三角瓶里，灭菌时把三角瓶放在灭菌器的上部和下部，灭菌结束后看水银温度计的温度和要求温度是否一致。此法只能验证温度，不能指示灭菌时间是否达到要求，因此是灭菌器验证的最低标准。三、自制测温管法原理：利用一些化学药品受热熔化后再冷却，晶体的外形不同的特性，把化学药品密封在小玻璃管内，灭菌时放在灭菌器里，灭菌完后观察晶体的形状，就可以判断温度是否达标。常用的试剂是苯甲酸，苯甲酸的熔点为121-123℃，跟我们要求的灭菌器的灭菌温度基本吻合，因此灭菌时把固体苯甲酸密封在小玻璃管内放进灭菌器，灭菌结束就可以观察苯甲酸的状态来验证灭菌器是否达到了要求温度。这种方法的局限跟留点温度计法相同，也只能指示灭菌时的温度，对灭菌时间是否达到要求无法判断。四、生物指示剂法原理：利用非致病性的嗜热脂肪杆菌的芽孢作为指示菌，来测定热力灭菌的效果。嗜热脂肪杆菌的芽孢对热的抗性较强，其耐热能力与病原微生物肉毒梭菌芽孢相似，以此为指示菌，验证灭菌器能否达到灭菌要求。生物指示剂分为三种：芽孢悬液、芽胞菌片、菌片和培养基混合指示管。一般放在灭菌容器的5个点：下层的前、中、后和上层、中层的中央点。灭菌后取指示剂接种到溴甲酚紫-葡萄糖蛋白胨水中，55-60℃培养2-7天，若培养基澄清、颜色没有变化即说明芽孢被杀死，灭菌器灭菌效果良好；如果培养基黄色浑浊，说明芽孢未被杀灭，灭菌器灭菌效果不合格。芽孢悬液和芽孢菌片的验证方法均是如此。目前实验室还常用商品化的生物指示管，其原理与芽孢悬液和芽胞菌片相同，指示管中有嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢和培养液玻璃小管，将指示管放在灭菌容器内的各个点上，高压灭菌后，将管中盛培养液的玻璃管挤碎，培养液从内部的小管中被放出，放入56℃培养箱中培养，同时做阳性对照。若是灭菌器灭菌效果不合格，指示管内的芽孢复活后生长会改变肉汤的颜色是肉汤变为黄色；若是灭菌器灭菌效果良好则管内芽孢被灭活不再生长，肉汤仍旧是原来的紫色。对于灭菌器的效果验证，目前并没有相关标准严格的要求验证的频次，但是实验室应当自行制定验证频次规定，并严格按照要求进行。从操作性和验证结论两个方面出发，小编推荐使用指示胶带和生物指示管，因为这两种方法操作简单，可以对灭菌效果进行全面的验证。

一、基本原理培养基的种类很多，不同微生物所需要的培养基不同。培养基制成后的物理状态可分为液体、固体、半固体三种类型。目前所用培养基均为已配制好的生物试剂和纸片。二、器材三角瓶、试管、烧杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、铝箔纸、角匙、杜氏小管、硅胶塞、电炉三、培养基的种类营养琼脂培养基、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰琼脂培养基、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（附加抗菌素）、平板计数琼脂、月桂基硫酸盐胰蛋白冻肉汤、煌绿乳糖胆盐肉汤、EC肉汤、高盐察氏琼脂、三糖铁琼脂等四、方法步骤1、培养基的制备：（1）称量：根据培养基的配方，称取适量药品于搪瓷杯中；（2）溶解：用量筒量取所需水量，置电炉上加热，一边搅拌，至完全溶解，加热至沸腾，拔掉电源，待冷却；（3）分装：根据不同需要，立即趁热分装入三角瓶或试管中，分装三角瓶以不超过三角瓶一半为宜，分装试管一般为管长的1/5（需根据试管的大小而定）。液体培养基如乳糖胆盐发酵培养基约分装10毫升左右。（4）塞硅胶塞：装好培养基的试管应塞上硅胶塞，松紧合适，紧贴管壁，不留缝隙，约1/2塞入内，这样即可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发。（5）包装：三角瓶棉塞头部应用锡箔纸包扎，试管集中于试管篓。2、无菌水的制备：（1）用10ml移液管量取9.2ml蒸馏水（稀释水）装入试管中。（2）用100ml量筒量取95ml蒸馏水（稀释水）装入150ml的三角瓶中。可置少许玻璃珠于三角瓶内，防止暴沸。（3）量取240ml蒸馏水（稀释水）于250ml的三角瓶中，塞上瓶塞用牛皮纸包扎好，高压灭菌备用。

　　一、目的要求　　掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化物的基本操作技术。　　二、基本原理　　1.从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其包括两个方面：　　（1）选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；　　（2）微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等计数来完成的。　　2.纯培养的确定：　　（1）确定其菌落观察特征；　　（2）结合显微镜检测个体形态特征的确定。　　三、器材　　1.菌种：迷曲霉；　　2.培养基：高氏Ⅰ号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基；　　3.溶液或试剂：10%酚 盛9ml无菌水的试管 盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂；　　4.仪器或者其他用具：无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、链霉素和土样、显微镜、血细胞计数板等。　　四、操作步骤　　1. 稀释涂布平板法　　（1）倒平板：将肉膏蛋白胨琼脂培养基， 高氏Ⅰ号琼脂培养基；马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至55-60℃， 高氏Ⅰ号琼脂培养基加入10%酚数滴，马丁氏琼脂培养基加入链霉素溶液。混匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿；　　（2）制备土壤稀释溶液：称取土样10g，放入盛有90ml无菌水并带入玻璃珠的三角烧瓶，振动约20min，使土样与水分混合，将细胞分散.用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释的土壤溶液；　　（3）涂布：将上述每种培养基的三个平板地面分别用记号笔写上10-4，10-5，10-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4，10-5，10-6三管土壤稀释液中各取0.1ml对号放入已写好室温下静置5-10min，使菌液吸附进培养基；　　（4）培养：将高氏Ⅰ号琼脂培养基平板;马丁氏琼脂培养基平板倒置于28℃温室中培养3-5天，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2-3天；　　（5）挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室培养，大菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。　　2.平板划线分离法　　（1）倒平板：按稀释涂布平板倒平板，并用记号标明培养基名称，土样编号和实验日期；　　（2）划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线.划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落；　　（3）挑菌落：同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。

由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏 3g蛋白胨 10gNaCl 5g琼脂 15—20g水 1000mlpH 7．4—7．6一、器材牛肉膏，蛋白胨， NaCl，琼脂；1mol/L NaOH， 1mol/L HCl；试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（ pH 5．5—9．0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。二、牛肉膏蛋白胨培养基的制作步骤1．称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。2．溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完-全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最-后补足所失的水分。3．调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精-确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。4．过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。5．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。6．加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保-证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）。7．包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。8．灭菌将上述培养基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。9．搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。10．无菌检查将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻-底。

各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和生物性状清楚的细胞群。因此凡符合上述情况的细胞群也可给以相应的名称，即文献中常称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。已鉴定的细胞可用于各种实验研究和生产生物制品，当前世界上已建的各种细胞系（株）已难胜数。体外培养细胞的种类和命名体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。名词的由来细胞株（cell strain）最初为W.Earle（1940）所采用，他把自己建立的小鼠结缔组织L系称为“株”，1951年，George Gey把其建立的人体宫颈癌细胞Hela系称为“株”。1954年，White另外使用了“系”来称呼A Carrel培养的鸡胚心脏的细胞群，细胞系（cell line）由此产生，之后这两个名词长期混用。即使在1979年国际组织培养协会专业术语委员会颁布“专业名词建议”和1984年在宁波召开的全国动物组织和细胞培养会议通过“动物细胞、组织和器官培养技术中的一些术语的译名和解释”之后，到目前为止国内对这两个名词的使用仍是混乱的，不仅在商品名中混用，在专业文献中亦有混用现象。现将细胞系和细胞株区分如下：1、细胞系（Cell Line）：原代培养物经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。因此，细胞系泛指可传代的细胞，细胞株是具有特殊性质的细胞系。（一）初代培养初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。（二）细胞系初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。为概念上的明确，对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。如 NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。（三）克隆细胞株从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）（四）二倍体细胞细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有8～10代，人胚神经胶质细胞15～30代；如从老龄个体取可传50则细胞生存期更短。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2～5代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。做实验选择原代细胞还是细胞株？原代细胞：从体内直接分离的细胞。功能、代谢、形态类似体内细胞的特点，因此原代细胞适用于分析单个细胞形态、代谢、功能。原代细胞的缺点是：细胞均一性差，因为从特定组织取下来的原代细胞可能处于不同的发育时期。增殖能力差、培养时间受限、转染效率低。细胞株：原代细胞经过长期培养和筛选后，功能、代谢、形态趋于均一化的无限增殖细胞。适用于整体水平实验。优点是：容易培养、好感染、干扰因素少、便于同步化、实验好操作。缺点是：与整体差别大、可能丧失原代细胞的特性，细胞株在长期传代过程中遗传物质发生变异。所以同一个学名的细胞株，有可能有完全不同的形态、代谢、功能表现。不同代数的细胞株，性质也可能完全不同。原代细胞由于转染效率低这个问题，应用受到了限制。自从腺病毒诞生后，因为其超强的感染能力，克服了原代细胞难感染的问题，使得原代细胞的使用变得更加简单。由于细胞实验后，很多时候需要做到动物体内，由于原代细胞有体内细胞的特点，为了细胞实验和动物体内实验的结果更加趋向一致性，因此用原代细胞来进行细胞实验更值得考虑。

如今质粒纯化不再是什么难题，那么做了这么次质粒抽提的你了解质粒纯化的原理吗？你知道哪些步骤对质粒纯化的成功起着关键作用吗？QIAGEN质粒抽提简单原理：在碱性条件下裂解细菌之后，将裂解液以指定的盐浓度加入QIAGEN-tip当中。质粒DNA将发生选择性的结合而从RNA、蛋白质及其他细胞污染物中被分离出来。1、制备细胞裂解产物 细胞产率很大程度上依赖于细胞裂解质量。因此制备澄清的细胞裂解产物是QIAGEN纯化方案中的重要一环，QIAGEN已经仔细针对最优的裂解条件进行了相关的专业设计。 对培养物进行收获和重悬之后，在RNase A存在的条件下使用NaOH-SDS（P2缓冲液）裂解细菌细胞。SDS溶解了细胞膜中的磷脂和蛋白成分，导致细胞裂解并释放出内容物。NaOH则对染色质和质粒DNA以及蛋白质进行变性。最优化的裂解时间能够让细胞中释放出最多的质粒DNA，却不会释放出与细胞壁结合的染色体DNA，从而使得质粒暴露于变性条件下的时间达到最小。碱性处理的时间过长可能导致质粒DNA形成无法恢复的变性状态。这一状态的质粒在琼脂糖凝胶中移动得更快，并且能够抵抗限制性内切酶的降解。随后通过加入酸性的醋酸钾（P3缓冲液）对裂解液进行中和。高的盐分会导致KDS*发生沉淀，变性蛋白、染色体DNA和细胞碎片随之被盐——去垢剂复合物所俘获。而质粒DNA由于其更小的体积和共价闭合性，得以重新正确地复性并存留于液相之中。由于裂解液中任何残存的SDS都会抑制DNA与QIAGEN树脂的结合，所以裂解液必须缓慢而彻底地进行混合，确保去垢剂完全沉淀。 从染色体DNA中分离质粒的原理主要基于细胞壁结合的染色体DNA与盐分、去垢剂和蛋白的不溶复合物之间的共沉淀效应。质粒DNA则仍存留于上方澄清的液相当中。裂解过程中的剧烈处理将会切断细菌染色体，导致上清液中发生染色体DNA碎片的污染。后续的反应条件将无法在化学上区分质粒DNA与染色体碎片，因此这两种成分将不会被QIAGEN树脂分离，进而在相同的盐浓度下被一同洗脱下来。在实验开始时加入的RNase A能够有效降解碱裂解过程中释放出的RNA成分。随之产生的RNA片段在裂解液所处的盐浓度和pH条件下不会与QIAGEN树脂结合。沉淀物残片通过离心，或QIAfilter Cartridge的使用得以去除，所生成的清亮裂解液可直接载入QIAGEN-tip中。这一阶段中溶菌液的清澈对于保证液相的良好流动性十分重要，最终也将保障获得完全去除蛋白质的DNA产物。 2、使用QIAfilter Cartridge澄清细菌裂解液 QIAfilter Cartridge是一类特殊的过滤装置，专为替代细菌碱裂解产物的离心步骤而设计。获得培养物沉淀后，细菌细胞在NaOH-SDS中得以裂解，并添加酸性醋酸钾参与中和，随后直接进入QIAfilter Cartridge中进行孵育。裂解液只需数秒钟便可通过过滤器，随之获得澄清的液相。在中和反应中形成的，包含染色体DNA、盐类、去垢剂和蛋白质的不溶复合物在此过程中被完全出去。QIAfilter Cartridge对于细菌裂解产物的净化作用相比传统离心法更为有效。此外，通过离心无法净化的小型SDS沉淀也可通过QIAfilter Cartridge完全除去。 3、QIAGEN-tip中DNA的结合和洗涤 清亮裂解液被载入预先平衡好的QIAGEN-tip当中，通过重力流动完成结合反应。裂解液的盐分和pH条件与QIAGEN树脂的优异选择性一起，确保了质粒DNA结合的特异性，降解后的RNA、细胞蛋白和代谢物则不会发生结合而随液相流出。进一步使用中盐缓冲液（QC缓冲液）洗涤QIAGEN-tip，以去除如痕量RNA和蛋白质（例如RNase A）等任何形式的污染物残留，该过程不会对质粒DNA的结合造成任何影响。QC缓冲液同时也会打断非特异性的相互作用，无需引入苯酚即可去除核酸结合蛋白。洗涤缓冲液中低浓度的酒精会消除非特异性的疏水性相互作用，从而提高所结合DNA的纯度。自此之后，质粒DNA被高盐缓冲液（QF或QN缓冲液）从QIAGEN-tip上有效洗脱下来。 4、通过离心实现脱盐和浓缩 洗脱的质粒DNA通过异丙醇沉淀进行脱盐和浓缩。在室温下进行沉淀反应以最大程度地减小盐分的共沉淀效应。在离心之后，使用70%乙醇对DNA沉淀进行洗涤，以去除残留的盐分；同时以更易挥发的乙醇替代异丙醇，是为了方便在后续去除液相。纯化后的DNA经简单的空气干燥步骤和小体积pH8.0的TE缓冲液或pH8.5的Tris?Cl的重新溶解，即可用于转染、测序、标记、克隆，以及任何其他的实验操作。 5、使用QIAprecipitator Module进行脱盐和浓缩 将洗脱得到的质粒DNA与异丙醇进行混合后，使用注射器将其加入试剂盒中的QIAprecipitator Module。该模块能够捕获异丙醇液体混合物中的DNA沉淀。推荐使用乙醇进行额外的洗涤步骤，最大程度地提升DNA的纯度。QIAprecipitator得到的DNA沉淀形成了薄层结构，通过使用注射器简单推动，即可使空气流经QIAprecipitator，在去除酒精的同时实现了DNA的充分干燥。之后使用试剂盒提供的TE缓冲液将DNA从QIAprecipitator洗脱至一个微量离心管中。任何常用的缓冲液或水均可作为替代物进行洗脱。如用纯水洗脱，则DNA应储存于–20°C的温度条件之下，因为DNA在缺乏缓冲系统及螯合剂的条件下会发生降解。这样获得的DNA产物适于进行转染、测序、标记、克隆，以及其他任何的后续应用。

质粒(plasmid) 广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有。从分子组成看，有DNA 质粒，也有RNA 质粒; 从分子构型看，有线型质粒、也有环状质粒: 其表型也多种多样。细菌质粒是基因工程中最常用的载体。通常，科学家利用质粒在靶细胞中进行基因的过表达。质粒的灵活性、兼容性、安全性、经济性等特性促进了分子生物学家将其应用于各种用途。一些常用的质粒类型包括：克隆质粒、表达质粒、基因下调质粒、基因敲除质粒、报告质粒、病毒质粒等。克隆质粒：旨在扩增目的DNA--pian段表达质粒：利用乳糖操纵子等结构过表达目的基因基因下调质粒：利用基因沉默（抑制mRNA翻译）的原理减少宿主细胞内源基因的表达基因敲除质粒：质粒中可插入基因敲除所需的元件，如用CRISPR/Cas9敲除时，质粒中含有Cas9蛋白的基因序列并插入一段设计好用来转录出gRNA的序列；同源重组法敲除时，质粒中插入一段目的基因的上下游同源序列报告质粒：整合有报告基因的重组质粒。报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用其表达产物标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。病毒质粒：对病毒的基因组进行改造，去除其致病感染性而保留其它功能，有利于目的基因灵活的进入细胞并整合到基因组中。到目前为止，quan世界的科学家在各种实验中广泛将质粒用于各种技术，包括荧光成像、重组DNA技术、蛋白质大规模生产、疾病模拟、药物开发和基因编辑等，其应用之广，使得质粒几乎存在于现在的所有生命科学实验室。

-　　以往，大量细胞分析提供了蛋白质、基因或代谢物的平均值。如今，单细胞分析正在揭示组织内各个细胞之间的差异。这些信息将有助于人们从细胞和分子层面上了解因果关系，也有助于解释复杂的疾病状态是如何产生并持续存在的。　　大量细胞分析无法了解不同的细胞类型及其功能，它只能提供一个读数，代表细胞的平均反应。这种平均值，不仅包括感兴趣的特征（比如细胞表面标志物或其他表型），还包括实验假象和错误，因此混淆了特定细胞对这些事件的贡献。　　对蛋白质组学而言，单细胞分析的局限性在于样本太小（单个细胞）以及它们所含的蛋白质数量极少。“获取细胞不是问题，“问题在于，为了达到统计能力，您必须分析数百个或数千个细胞。每次LC/MC分析大约需要一小时，那么一项简单的研究可能就需要十天左右，前提是一切都按计划进行。”　　此外，人类细胞会产生8万到40万种不同的蛋白质。并非所有蛋白都同时表达，有些是某个基本分子的不同亚型（isoform）。“大海捞针”的比喻也许是恰当的。单细胞蛋白质组学方法每天最多能分析300个细胞，对每个细胞中的2500个蛋白进行定量分析。　　单细胞工作流程　　单细胞流程当然也是从样本处理开始。对样本进行处理，使细胞分开和悬浮，然后通过荧光活化细胞分选（FACS）进行分离。单个细胞被分配到微量滴定板的各个孔中或芯片型分析系统上，在那里进行裂解。干扰质谱分析的裂解剂需要除去，但由于纯化会导致样本损失，因此研究人员尽量避免使用。　　FACS是细胞分选的shou选方法，但也存在缺点。损失率高（有时非常高），需要训练有素的操作人员，而且购买和操作成本都很高。　　当然，损失并不仅仅发生在细胞分选阶段。“粘稠的蛋白质很难通过液相色谱（LC）分离，因此这个步骤也会造成损失。这将会进一步造成灵敏度问题或分析偏倚。有时，您只是无法从单个细胞的蛋白质中产生足够的离子。”　　为了解决这些灵敏度问题，一些操作方案将未标记的载体蛋白添加到混合物中，以缓解小样本量带来的损失。虽然这些方法有点用，但仍需要质谱技术的进步，特别是在电离效率方面的进步，才能处理小的样本量和体积。　　“如果没有自动化液体处理系统，这些工作流程将无法实现，自动化系统带来了准确的纳升级流体操作，以及一致性和稳定性。”　　早期对单细胞蛋白质组学的尝试使用了基质辅助激光解吸电离（MALDI），这是一种软电离技术，可以保留不稳定的分子特征，并最大限度减少样本损失和样本制备步骤。　　基于MALDI的方法是在上世纪90年代首次使用的。人们采用MALDI作为离子源，并用飞行时间（TOF）作为质量分析器，从而提供一种功能性的单细胞分析。不过，这些技术存在三个主要缺点：MALDI不能在时域内分离肽段，无法对大量蛋白质进行测序，而且MALDI电离的可变性会影响定量的准确性。　　另一种电离蛋白质的方法，电喷雾电离（ESI），则更容易实现测序，因为它很容易与各种分离方法（如毛细管电泳）相结合。然而，ESI需要大量的样本制备，这可能导致损失，让人们无法接受。　　应对未来的挑战　　单细胞蛋白质组学也许更适合勇敢的人。这项技术还需要很多工作，才能满足成本、灵敏度、稳定性和可靠性等方面的需求，应用于日常科研、生物制造和诊断。　　“不过在此之前，人们必须解决单细胞分离的挑战，以及验证质谱技术和流程的挑战。此外，临床背景下的技术人员还需要更多的全面整合流程。目前运行16个样本大约需要两到三个小时，这也需要改进。”

载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。这里主要介绍下一个合格质粒的组成要素、载体的一些基本知识以及如何阅读质粒图谱。一、一个合格质粒 的组成要素复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段P/E 启动子/增强子Terms 终止信号加poly(A)信号 可以起到稳定mRNA作用。二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。(1)Ampr 水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。(2)tetr 可以阻止四环素进入细胞。(3)camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。(4)neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶 使G418(长那霉素衍生物)失活(5)hygr 使潮霉素β失活。第三步：看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号启动子-促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子，负调控序列。核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs)：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG(起始密码)和SD序列。转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down-stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down-stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly(A)加尾信号。回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.三、介绍一下关于载体的知识1.什么是载体即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞)，需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体(vector)。P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。2.载体的分类按功能分成：(1)克隆载体 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。(所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨行载体)(2)表达载体 具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。按进入受体细胞类型分：(1)原核载体 (2)真核载体 (3)穿梭载体(sbuttle vector)指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间).P.S.穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。3.基因工程载体的3个特点：(一)都能独立自主的复制：载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。(二)都能便利的加以检测： 如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。(三)都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。4.载体的选择和制备：选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：(1)克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大，小选小)。如(2)表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。(3)对原核表达载体应该注意3点：①选择合适的启动子及相应的受体菌;②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。选用质粒(最常用)做载体的4点要求：①选分子量小的质粒，即小载体(1-1.5kb)→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多(也有大载体);②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地;④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr(试一试)。

慢病毒包装简要步骤以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。1. 取1.5 ml灭菌EP管，加入1.5 μg包装混合质粒和0.5 μg表达质粒以及250 μl的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5 min。2. 取1.5 ml灭菌EP管，取9 μl 脂质体2000 l溶于250 μl无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5 min。3. 将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20 min4. 用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。5. 在六孔板中每孔，加入1 ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。6. 将1 ml重悬的293T细胞(1×106个细胞/ml)加入到平板中。37 ℃ CO2孵箱中孵育过夜。7. 移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除，代之以DMEM(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)。7. 转染后48-72 h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20 min，去除沉淀。8. 病毒上清-80 ℃贮存。包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。注意事项1. 在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒的滴度。病毒的滴度可以通过转染Hela细胞，然后使用抗体筛选稳定的细胞转染株，进行计数和数值统计。2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。

细胞凋亡(apoptosis)具有多种生化特征，包括细胞皱缩、质膜起泡、染色体浓缩（固缩）、细胞核碎裂（核碎裂）、形成 DNA 条带以及细胞最终被吞噬体吞入。相较于细胞坏死，凋亡细胞不会引发炎症反应，并且体内细胞凋亡仅作用于单个细胞。凋亡和坏死代表了细胞死亡的两个极端，此外还存在其他变异形式。例如，坏死性凋亡或自噬，它们具有与细胞坏死和细胞凋亡相通的一些特性。细胞死亡的途径很多，因此研究人员需要认真观察其形态学和生化特征，在谨慎选择的时间节点检测多个生化标记物，确定具体实验体系内的细胞死亡机制。1.细胞凋亡的过程健康细胞进入凋亡是由信号决定的。细胞凋亡分为两个阶段：一、激活期：接受来自内部和外部的死亡信号并作出反应。二、死亡执行期：即执行一套死亡程序，如核固缩、细胞皱缩、细胞膜起泡和 DNA 片段化等。2.动物细胞中蛋白质酶解级联系统对凋亡的介导所有的动物细胞都有一种相类似的控制程序性细胞死亡的机制，即通过自杀性蛋白酶家族(caspase)的介导，在诱导程序性死亡信号的作用下通过自我切割而激活。激活的caspase又可激活家族中的其他成员，引起蛋白质酶解的级联反应。但，caspase家族作用时分成一些亚组被激活，每一组caspase对应不同的激活信号，如caspase-3、6、7和8在FAS/TNF介导凋亡中起作用；caspase-9和3一起参与线粒体中Apaf-I、细胞色素C介导的凋亡。3.细胞外、细胞内信号对凋亡的激发细胞外信号来自相邻细胞，如肿瘤坏死因子(TNF) 与其受体(TNFR) 结合，招募FADD、TRADD和前提caspase-8结合，激活 caspase-8 引起细胞凋亡。细胞内源信号包括DNA损伤、细胞质中Ca2+浓度过高、极度氧胁迫，由细胞内的损伤激活BCL-2 家族促凋亡前体蛋白(BAD/BAX)，从而引起细胞色素C与Apaf-1因子、前体caspase-9装配成复合物，将前体caspase-9激活作为起始caspase，执行细胞凋亡。

重组蛋白的产生是应用了重组DNA或重组RNA的技术从而获得的蛋白质。体外重组蛋白的生产主要包括四大系统:原核蛋白表达，哺乳动物细胞蛋白表达，酵母蛋白表达及昆虫细胞蛋白表达。重组蛋白获得途径：重组蛋白需要使用表达系统来对其进行制备，其获得途径可以分为体外方法和体内方法。两种方法的前提都是应用基因重组技术，获得连接有可以翻译成目的蛋白的基因片段的重组载体，之后将其转入可以表达目的蛋白的宿主细胞从而表达特定的重组蛋白分子。体外重组蛋白的生产主要包括四大系统：原核蛋白表达（最常用的大肠杆菌蛋白表达），哺乳动物细胞蛋白表达（常用的细胞CHO，HEK293），真核表达系统（酵母）及昆虫细胞蛋白表达。合适表达系统的选择取决于重组蛋白的特性、重组蛋白的预期应用以及该系统能否生产足够量的蛋白质，根据自身的下游运用选择合适的蛋白表达系统，提高表达成功率。重组蛋白表达系统：（1）目前应用最广泛的表达系统有三大类，大肠杆菌(Esherichia coli)表达系统、酵母表达系统、CHO细胞表达系统。其中，大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主菌，已应用于许多具有重要药用价值蛋白的生产。大肠杆菌表达系统具有许多优点，如生长快、培养成本低廉、遗传背景清楚和易实现高密度培养等。大肠杆菌DH5α是一种诱变菌株，主要表现对外源DNA的免疫缺乏。大肠杆菌DH5α是基因工程常用的宿主菌之一，相比于正常菌种缺少了一定的免疫机制。（2）不同的表达系统和培养方法显着影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞膜内、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的的表达系统。重组蛋白表达系统重组蛋白种类：目前比较热门的重组蛋白主要为细胞因子类，而细胞因子主要包括如下：按功能分，可分为以下几种：1、白细胞介素（Interleukin，IL）由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。由于最初是由白细胞产生且又在白细胞间发挥作用，所以得名，现仍沿用此名。2、干扰素（interferon，IFN）具有干扰病毒复制的能力，故得名。其具有十分广泛的生物活性，在免疫应答和免疫调节中发挥重要作用，也是主要的促炎细胞因子之一。干扰素分为：I型（7种，如IFN-α和IFN-β）和II型（仅有IFN-Y）。3、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）由于在体内外均可直接杀伤肿瘤细胞而得名。其家族成员约有30个。主要成员：（1）TNF-α，一种单核因子主要由单核细胞和巨噬细胞产生；（2）TNF-β，一种淋巴因子，主要由淋巴细胞、NK细胞等产生，其生物学活性与TNF-α相类似。4、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）一组在体内外均可选择性刺激造血祖细胞增殖、分化并形成某一谱系细胞集落的细胞因子，包括巨噬细胞CSF、粒细胞CSF、巨噬细胞/粒细胞CSF、干细胞因子等。5、生长因子（growth factor，GF）一类可介导不同类型细胞生长和分化的细胞因子，根据其功能和所作用细胞的不同，分别命名为转化生长因子（TGF）、神经生长因子（NGF）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等。6、趋化性细胞因子（chemokine）一类对不同靶细胞具有趋化效应的细胞因子家族，可由白细胞和某些组织细胞分泌，是一个包括60多个成员的蛋白质家族。大部分成员含4个保守的半胱氨酸（cysteine，C）根据其N端半胱氨酸的排列方式，可分为CXC、CC、C、CX3C四个亚族。

1、提高胶回收量的技巧1) 增加电泳时的上样量。2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性(电荷)和疏水性使DNA与柱子结合。因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul(PH 5.0，3mol/L的 NaAC);为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30%异丙醇在加热溶解胶后的液体里。7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟(大约需10分钟)，以使乙醇充分挥发。8) 最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱(不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱);洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。2、PCR 产物回收的详细方法和步骤1) 普通胶回收如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可以切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚/lv仿抽提干净，乙醇沉淀即可。2) 从低熔点凝胶回收DNA纯化DNA--pian段 加与凝胶体积相等的TE(10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA )，置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚(TE饱和，TE封在上层，取下层酚)，轻轻混匀(不用混匀)，12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用(可用于目的基因结构分析，探针制备等)。3) 扩增特异性好的PCR回收如果PCR扩增特异性好，只是简单的PCR产物纯化回收，可以在PCR产物中加入50ug/ml 的蛋白酶K，37度1h，酚/lv仿抽提一次，lv仿抽提一次，上清加入0.1体积的醋酸钠，2.5体积的无水乙醇沉淀回收。

　　(1)、糖(醇)类发酵试验　　不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶,因而发酵糖(醇)的能力各不相同.其产生的代谢产物亦不相同,如有的产酸产气,有的产酸不产气.酸的产生可利用指示剂来判定.在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS. 2(黄色)一6 . 8 (紫色)],当发酵产酸时,可使培养基由紫色变为黄色.气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明.例如：甘露醇发酵试验。　　(2)、甲基红(Methylred)试验(该试验简称MR试验)　　很多细菌,如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸再被分解,产生甲酸、乙酸、乳酸等,使培养基的pH 降低到4 . 2 以下,这时若加甲基红指示剂呈现红色.因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 (红色)一pH6 . 2 (黄色).若某些细菌如产气杆菌,分解葡萄糖产生丙酮酸,但很快将丙酮酸脱梭,转化成醇等物,则培养基的pH 仍在6 . 2 以上,故此时加入甲基红指示剂,呈现黄色。　　(3)、靛基质(吲哚)试验　　某些细菌,如大肠杆菌,能分解蛋白质中的色氨酸,产生靛基质(吲哚),靛基质与对二甲基氨基ben甲醛结合,形成玫瑰色靛基质(红色化合物)。　　（4）氨基酸脱羧酶试验　　具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培养基变碱。使指示剂显示出来。结果：对照管应呈黄色，试验管呈蓝绿色（指示剂为溴麝香草酚蓝）为阳性，若试验管呈黄色为阴性。若对照管呈现蓝-绿色则试验无意义，不能作出判断。这主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。例如：赖氨酸脱羧酶利用试验。　　（5）淀粉水解试验　　细菌对大分子的淀粉不能直接利用,须靠产生的胞外酶(淀粉酶)将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖),再被细菌吸收利用,细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明,即用碘测定不再产生蓝色。　　（6）硫化氢试验　　某些细菌能分解含硫的氨基酸(肌氨酸、半肌氨酸等),产生硫化氢,硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐,形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁.为硫化氢试验阳性,可借以鉴别细菌。　　(7)、柠檬酸盐利用试验　　柠檬酸盐培养基系一综合性培养基,其中柠檬酸钠为碳的唯1来源.而磷酸二氢按是氮的唯1来源.有的细菌如产气杆菌,能利用柠檬酸钠为碳源,因此能在柠檬酸盐培养基上生长,并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐,使培养基变为碱性.此时培养基中的溟廖香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色.不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌,在该培养基上不生长,培养基不变色。

传统方法常规宏观菌落形态学观察,主要观察菌落在其适合的培养基上的生长状况:细菌在固体培养基上的生长形态、大小、颜色是否均匀一致,菌落个体表面及边缘的生长状况；在液体培养基上的浑浊状况、沉淀状况、液面菌膜状况；半固体上穿刺接种后,观察细菌是否沿着接种线生长以及其生长状态是呈毛刷样生长还是均匀生长,上下生长是否一致.在鉴别培养基上培养,观察结果是否跟预期结果相同。细菌的个体形态学观察,即通过显微镜观察.观察前细菌需要着色,要根据预先确定的观察项目选择与之相对应的染色方法,目前常用的染色方法包括革兰氏染色法、美蓝染色法、Ziehl—Neelsen染色法、姬姆萨染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法等.尽量挑选对数生长期的细菌进行染色观察,此时的细菌生长处于幼期,利于观察,因为一些陈旧细菌的染色结果会有变化,如本为革兰氏阳性菌经过长期搁置后染色结果可能为革兰氏阴性.同时细菌培养时要注意培养基的挑选,一些细菌的特殊结构如荚膜、鞭毛、菌毛、芽胞等,其表达是需要在特定的培养基上才能正常发育,有的细菌如炭疽在一般的培养基上不形成荚膜,只在动物体内形成明显的荚膜,所以需先接种实验动物后用病料进行涂片镜检.在镜检时观察细菌基本形态结构和大小及其排列状态、菌端形状、有无两极染色、有无形成芽胞和荚胞等。形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有重要的意义,生化试验是根据细菌培养过程中不同菌种所产生的新陈代谢产物各异,表现出不同的生长特性.通过生物化学的方法来检测这些物质的存在与否,从而能够得到细菌的鉴定结果.如糖(醇)类代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、有机酸盐和胺盐利用试验、呼吸酶类试验、毒性酶类试验等。血清型鉴定是根据细菌具有相对特异性的抗原结构这个特点进行微生物鉴定的特异方法.抗原的特异性程度又存在于属间细菌所共有的共同抗原,这种抗原的存在,能表明其属性。另一类特异性抗原只存在于特定的种、型,是确定细菌种、型的重要依据，通过专门的分型血清即可对这些细菌的血清型进行鉴定。细菌毒力的测定,病原菌侵入机体能否引起疾病与其本身的毒力、侵入机体的数量和侵入部位有关.不同的病原菌或同种细菌不同的型或株,毒力常不一致.常用LD50或ID50表示毒力,即在一定时间内,能使一定条件的某种动物半数死亡或感染需要的最小细菌数或毒素量.毒力测定在菌种鉴定过程中可用于鉴别一些有代表性的菌株.LD50可用Reed—Muench公式进行计算。分子生物学鉴定分子生物学鉴定目前比较流行的主要是核酸检测技术,包括基因测序、指纹图谱技术、基因探针技术、聚合酶链反应(PCR)、GC含量测定等.PCR和核酸杂交单独或结合在仪器已经形成比较经典的核酸检测技术,目前这两者已经得到了较大范围的推广和应用。核酸检测技术原理DNA的G+C含量测定法这种方法是根据细菌的DNA中G+C含量的特异性来进行细菌鉴定,通过熔解温度(Tm)法或浮力密度法测定细菌DNA中G+C的含量,通过对比来鉴定细菌。16S rRNA鉴定细菌的核糖体RNA(rRNA)基因高度保守且进化速度缓慢,在漫长的进化过程中保留了rRNA基因结构和功能的同源性,在微生物染色体上可存在多个拷贝,以rRNA基因片段为探针可检出含有rRNA基因的DNA片段.分析杂交后得到的rRNA指纹图,为菌种定型和近缘菌株的鉴定提供了一种新技术.针对rRNA基因的核糖体分型可成功地区分多个菌种的相关菌株,因此该技术也被广泛称作核糖体分型技术.原核生物含有23S、16S和5S三种 rRNA,其大小分别约为3000、1500和120个碱基.其中作为小亚单位核糖体RNA的16S rRNA的大小最适合于核糖体分型.一般完成l6S rRNA序列测定后,在GenBank中与已知的序列进行BLAST分析,从而得出鉴定结果。扩增片段长度多态性(AFLP)分析这是一种测定基因组限制性片段的DNA指纹技术,通过PCR选择性地扩增整个基因组DNA的内切酶片段,在分辨率高的聚丙烯酰氨凝胶上电泳,产生一组特异的DNA限制性片段的指纹图谱.与其他DNA指纹技术相比有其独特的优点:可用于各种大小不同的基因组的指纹分析,为研究细菌属乃至株间的亲缘关系提供一个有效手段；具有一定的灵活性,可通过特异性PCR引物的设计和内切酶组合的选择,调整AFLP图谱中限制性片段的适宜数目；由于适用了严格的PCR条件和高分辨率的聚丙烯酰氨凝胶电泳,因而重复性好,分辨率高；AFLP不仅仅是简单的指纹技术,而且可作为连接遗传图谱与物理图谱间的桥梁而用于基因组的研究。限制性片段长度多态性(RFLP)分析原理是用限制性内切酶将细菌基因组DNA进行切割,之后在琼脂糖凝胶上电泳分离,以显示不同种群基因组DNA的限制性片段长度多态性.RFLP产生的指纹图谱更适用于细菌种间及种内株间的分型鉴定。随机扩增DNA多态性(RAPD)分析,又称为随意引物PCR(AP—PCR)它是一种DNA指纹多态性分析技术,其理论依据是不同的基因组中与随意引物匹配的碱基序列的位点和数目可能不同,因而用一组人为设计的核苷酸作为引物,通过PCR随机扩增可产生物种特异性的DNA带谱。

培养基的制备原理培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配置而成的一种混和营养基质，用以培养或分离各种微生物。因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。操作步骤1、计算称量 根据配方，计算出实验中各种药品所需要的量，然后分别称(量)取。2、溶解 一船情况下，几种药品可一起倒入烧杯内、先加入少于所需要的总体积水进行加热溶解。加热溶解时，要不断搅拌。如有琼脂在内，更应注意。待完全溶解后，补足水分到需要的总体积。3、调节pH 用滴管逐滴加入1N NaOH或lN HCl边搅动；边用pH试纸测其pH值，直到符合要求时为止。4、过滤 要趁热用四层纱布或滤纸过滤。5、分装 按照实验要求进行分装。6、加塞 培养基分装好以后，在试管口或烧瓶口上应加上棉塞。7、灭菌 在塞上棉塞的容器外面再包一层牛皮纸，便可进行灭菌。细菌的的分离与接种技术生长上应用的菌种必须是纯种，但是筛选菌种时通过增殖培养后得到的菌种并不是纯种，还需进行纯种分离；就是在生产上长期应用的菌种，由于长期使用，也容易发生退化与变异，也需进行纯种分离。因此纯种分离是微生物学的主要技术之一，操作务必熟练。常用接种方法有：固体培养基接种、半固体培养基接种、液体培养基接种。材料1.菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌2.接种工具： 接种环、酒精灯、接种箱方法1.固体培养基：（1）连续划线适合于接种材料中含菌不太多的标本（如尿液等）或培养物。（2）分区划线适合于粪便等含菌量较多的标本或污染菌种的分离纯化。在培养皿底部注明接种菌名、接种者姓名、日期等，将平皿倒置于37℃温箱中。（为什么？）（准备室应给准备好分区划线和连续划线的示教）2.半固体培养基：穿刺接种不可穿至管底（3/4），循原路退出。37℃温箱中培养。今年为新换菌种（变形杆菌），动力很好。3.液体培养基：取标本后在接近液面的管壁上轻轻研磨，并粘取少许肉汤调和，使细菌混合于肉汤中。37℃温箱中培养。观察细菌的生长现象不同种类的细菌在培养基上生长，往往表现为不同的生长现象，可以通过生长现象的观察，进行细菌的初步鉴定。材料菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乙型链球菌、变形杆菌培养基：固体培养基、液体培养基、半固体培养基操作1．固体培养基多用于观察细菌的菌落、菌苔、细菌的分离培养或纯培养。可将菌落分为三个类型：（1）光滑型菌落（Smooth type Colony）：又称S型菌落，此种菌落特点为表面光滑、湿润、边缘整齐、至于其它特点如凸起或扁平、色素、透明度、溶血等可因菌种而异。（2）粗糙型菌落（Rough type Colony）：又称R型菌落，此种菌落表面粗糙、干燥、边缘不整齐。（3）粘液型菌落（Mucoid type Colony）：又称M型菌落，此型菌落表面光滑、湿润、呈粘液状，以接种环触之可拉出丝状物，“成丝试验”阳性可作为鉴别，如肺炎杆菌。固体平板上，菌量多的部分，菌落常融合成片，形成菌苔，菌苔一般不做为鉴定的指标。2．半固体培养基多用于观察细菌的动力。（金黄色葡萄球菌、变形杆菌）在半固体培养基中，无鞭毛细菌沿接种线生长，接种线清晰，培养基澄清；有鞭毛细菌弥散生长，接种线模糊不清，周围培养基变混浊；借此可以判断细菌有无动力。3．液体培养基接种多用于测定细菌的生化反应（肉汤、葡萄糖蛋白胨水、各种单糖发酵管等液体培养基）、工业微生物发酵、观察细菌的不同生长现象。肉汤在未接种细菌前是澄清的，接种细菌后可有以下三种生长现象：（1）混浊生长：液体变混浊。 （大肠杆菌）（2）沉淀生长：上层培养液澄清，管底有絮状或颗粒状沉淀物。（链球菌）（3）形成菌膜：培养液澄清，表面形成一层菌膜。 （枯草杆菌）哪些细菌在液体培养基中可形成菌膜？细菌的分布细菌种类多、繁殖快、适应环境能力强，因此，细菌广泛分布于自然界，在水、土壤、空气、食物、人和动物的体表以及与外界相通的腔道中，常有各种细菌和其它微生物存在。在自然界物质循环上起重要作用，多数对人类有益，对人致病的只是少数。材料1、普通固体培养基 血琼脂平板2、碘酒、肥皂、自来水等方法1、空气中的细菌大多为非致病菌，是实验操作污染的重要来源。检查时用普通琼脂平板，打开平板盖，放置10min。37℃温箱中培养。2、手指上有细菌存在，检查消毒前后细菌分布情况说明为什么要饭前便后要洗手，病从口入的道理。选择男女各一名同学。3、飞沫中有细菌，说明为什么不要对着人咳嗽、打喷嚏，不仅不礼貌，从微生物学角度来说，可以传播一些疾病。（检查飞沫中的细菌为什么要用血琼脂平板）。微生物不仅在自然界分布广泛，在人体的体表以及与外界相通的腔道，存在着不同种类和数量的微生物。成年人体有1013个细胞，而细菌却可达1014，其重量达1271g，近3斤，其中肠道中有1000g，粪便干重的1/3是细菌，皮肤上有200g，口腔、鼻腔、外耳道、泌尿生殖道、眼部有71g。微生物种类繁多、分布广泛，建立起“微生物无处不有的概念”， 严格无菌操作，树立牢固的无菌观念。注意事项是否R型菌落的细菌致病性都弱？比较日照与济宁空气质量。下次实验看细菌分布实验的结果。注意无菌操作，培养树立牢固的无菌概念是微生物学实验的一项重要任务。

    1. 适度消化细胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901几种癌细胞处理时间可适当放长，一般处理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比较容易脱落，2min足矣，P19Cl6和293细胞贴壁不紧，可在PBS漂洗后，直接换新鲜培养基打散。    2. hao用塑料瓶培养，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾胶原包被一下培养瓶，或者用盐酸对培养瓶进行蚀刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以帮助细胞贴附新的培养瓶，细胞不易贴壁，建议加多聚赖氨酸处理。    3. 正确配制消化液或培养液。    4. 使用合适的细胞外基质或贴壁试剂。    5. 复苏新的细胞，DI 一周用20%血清帮助细胞复原。    6. 传代接种一定要铺的均匀，避免细胞抱团生长。    7. 细胞传代24小时之内，Hao不要晃动，以免影响贴壁。    8. 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜上，因此培养在有胶原的底物上有利于生长。人或小鼠表皮细胞培养，可以用γ射线照射后的3T3细胞为饲养层，另外降低pH、Ca2+含量和温度，均有利于上皮细胞生长。

1.支原体污染的普遍性支原体污染是细胞培养领域遇到的性问题，据文献报道，综合美国食品药品监督管理局（FDA）、美国模式菌种收集中心(ATCC)等机构收到的相关数据，世界各国细胞系支原体污染的平均比例为30-60%。该数据未统计中国大陆的数据，但可以确定，大陆地区的支原体污染比例与此相当，或更严重。2.支原体污染的危害根据已发表的支原体污染研究文献，支原体污染细胞后，几乎能影响每一个细胞参数。1）支原体污染可能导致细胞染色体的异常和损伤，改变细胞的代谢、生长、形状、附着。2）支原体影响被污染细胞的基因表达。相关研究表明，支原体污染的细胞系与对照组比较，有多达200个基因表达差异达2倍以上。3）导致MTT等细胞毒性实验结果严重错误。支原体对MTT有额外还原作用。4）支原体污染能耗尽营养物，促进代谢积累，重度支原体污染导致pH改变。5）诱导或抑制细胞因子表达，并改变培养细胞的代谢、增殖特征及形态。支原体污染可以直接影响L-arginine的代谢6）支原体污染可以诱导树突状细胞成熟，这对于开展人体免疫细胞的肿瘤治疗的影响将是灾难性的。3.支原体污染的隐蔽性支原体大小约0.1-0.6微米，体积比病毒稍大，轻度到中度的支原体污染不会明显改变细胞培养液的浑浊度和pH值，也不会导致细胞形态或生长速度的明显改变，所以科研人员很难及时发现体外培养的细胞已经被支原体污染，进而改变了基因表达谱，显示虚假的实验数据和实验结果。通常情况下，如果不排除支原体污染因素，很多实验结果往往缺乏说服力。2013年，Ding级期刊《Nature》明确要求，在涉及细胞培养的科研工作中，必须进行支原体检测，并排除其影响。

细胞生长缓慢的常见原因:(1)培养基可能缺乏细胞生长所需的某种因子。通常情况下，当小伙伴购买细胞，并没有按照ATCC或国内细胞库推荐的方法制备培养基，使用实验室兄弟姐妹使用的培养基来培养细胞。解决方法一般是按照推荐的方法制备培养基，或直接购买培养细胞的培养基。(B)细菌、支原体、真菌等污染:虽然培养基中通常添加双抗体(青霉素和链霉素)，但如果无菌操作观念不强，仍有可能造成污染。处理方法:如果有冷冻细胞，可以丢弃污染细胞。当然，丢弃并不是随意的，扔进垃圾桶。应按照实验室生物安全规定进行。然后复苏培养物，建议培养箱完全消毒。如果不冷冻，而且这种细胞非常珍贵，常用的治疗方法是药物治疗:细菌污染加5-10倍的抗生素;真菌污染加抗真菌药物;支原体污染再加上抗支原体药物，具体药物可以咨询技术支持，他们会更加专业。(C)许多细胞的生长依赖于密度。如果传代后细胞密度过小，也会影响细胞生长。这段时间没有什么特别好的，就是更换液体。如果细胞培养瓶为T75，则可以消化、离心、复苏，然后接种到T25瓶中。(4)冷冻细胞中添加DMSO(二甲基亚砜)的量不正确，没有逐渐梯度冷却。下一次恢复后的细胞总是坏的。处理方法:按推荐的冷冻保存方法制备冷冻液。部分细胞适合10% DMSO，部分细胞适合5% DMSO;严格遵循渐变冷却的原则，细胞恢复后迅速解冻。(5)换液间隔时间太长。一些小伙伴真的把细胞“佛”系生长。当他们想到它的时候，才会换下液体，相信一个句子。“你已经是一个成熟的细胞了。你应该学会养活自己，成长”。在这种情况下，细胞培养瓶中积累了大量的细胞代谢废物，影响细胞活性。推荐:勤奋点(6)细胞的“消化”时间不宜过长，减少对细胞的损伤;此外，EDTA一般添加到胰腺酶中，螯合钙离子，影响细胞粘附。治疗方法:控制细胞“消化”时间，尽量去除干净的胰蛋白酶和EDTA。PH值:细胞需要在一定的PH值下生长，这个小朋友知道。但是很多时候PH值是我们忽略的东西，这也是想强调的一点。随着使用时间的增加，我们使用的介质可能会慢慢变成碱性!(当然，它也可能变酸，但改变碱是常见的)。一般来说，过碱的培养基会影响细胞的生长。治疗:简单的方法就是更换新鲜的培养基!当然，如果你有时间和条件，你可以调整介质的pH值。

秦皮为本樨科白蜡树属植物白蜡树（Fraxinus Chinensis Poxb）或苦沥白蜡树（F.rhynchophylla Hance）或小叶白蜡树（F.bungeana DC）的树皮,味苦，性微寒。具有清热、燥湿、收涩作用。主治温热痢疾、目赤肿瘤等症。秦皮中含有多种内酯类成分及皂苷、鞣质等，其中主要有七叶苷、七叶内酯、秦皮苷及秦皮素等。多有抗菌消炎的生理活性，七叶内酯对细菌性痢疾、急性肠炎有较好治疗效果，兼有退热作用，毒付作用小，几无苦味。适于小儿服用。秦皮中主要成分的结构及性质1．七叶苷（esculin），又叫马粟树皮苷：白色粉末状结晶，mp205～206℃。易溶于热水（1：15），可溶于乙醇（1：24），微溶于冷水（1：610），难溶于乙酸乙酯，不溶于乙mi、lv仿。在稀酸中可水解。水溶液中有蓝色荧光。2．七叶内酯（esculetin）：黄色针状结晶，mp276℃。易溶于沸乙醇及氢氧化钠溶液，可溶于乙酸乙酯，稍溶于沸水，几不溶于乙mi、氯仿。3．秦皮苷（fraxin）：mp205℃。4．秦皮素（fraxetin）：mp227～228℃。实验原理七叶苷、七叶内酯均能溶于沸乙醇，可用沸乙醇将二者提取出来，再利用二者在乙酸乙酯中的溶解性不同而分离之。实验方法（一）提取：取秦皮粗粉150g于索氏提取器中，加400ml乙醇回流10-12小时，得乙醇提取液，减压回收溶剂至浸膏状，即得总提取物。（二）分离：在上述浸膏中加40ml水加热溶之。移于分液漏斗中，以等体积氯仿萃取二次，将氯仿萃取过的水层蒸去残留氯仿后加等积乙酸乙酯萃取二次，合并乙酸乙酯液，以无水硫酸钠脱水，减压回收溶剂至干，残留物溶于温热甲醇中，浓缩至适量，放置析晶，即有黄色针状结晶析出。滤出结晶。甲醇、水反复重结晶，即得七叶内酯。将乙酸乙酯萃取过的水层浓缩至适量，放置析晶，即有微黄色晶体析出。滤出结晶。以甲醇，水反复重结晶，即得七叶苷。（三）鉴定：1．化学检识：取七叶苷、七叶内酯各少许分别置试管中，加乙醇1ml溶解。加1%FeCl3溶液2-3滴，显暗绿色，再滴加浓氨水3滴，加水6ml，日光下观察显深红色。2．薄层鉴定：吸附剂：硅胶G样品：七叶苷、七叶内酯标准品及自制七叶苷﹑七叶内酯的醇溶液。展开剂：甲醇-甲酸乙酯-甲苯（1：4：5）显色：1）UV254灯下观察，七叶苷为灰色荧光，七叶内酯为灰褐色。2）以重氮化对硝基苯胺喷雾显色，七叶苷和七叶内酯均呈玛瑙色。结果：七叶苷Rf=0. 04，七叶内酯Rf=0.28

磷酸盐缓冲液(简称PBS)的是生物化学中常用的一种阻碍溶液pH变化的缓冲溶液，这种由盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，磷酸盐，氯化钾和磷酸钾组成。组份浓度：137 mM 氯化钠，2.7 mM 氯化钾，10 mM 磷酸二氢钠，2 mM 磷酸二氢钾。本文总结了PBS和D-PBS溶液的配制方法。1. 常规PBS磷酸盐缓冲液组成成份：磷酸二氢钾 34 g1 mol/L氢氧化钠溶液 175 ml蒸馏水 825 mlPH 7.2配制：先将磷酸盐溶解于500 mL蒸馏水中，用1 mol/L氢氧化钠溶液校正pH后，再用蒸馏水稀释至1000 mL。稀释液：取储存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL。分装每瓶100 mL或每管10 mL，121 ℃高压灭菌15 min。用途：主要用于一些化学实验中不影响实验反应的情况下调节pH值，以便让实验的化学反应在最佳条件下进行。部分用于食品或是饲料行业加工，如食品或者饲料真菌毒素检验中Elisa方法的洗板应用或者食品微生物检验中的稀释缓冲液。2. PBS Buffer的配制具体步骤组份浓度：137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4配制量：1 L配制方法：（1）称量下列试剂，置于1 L烧杯中。NaCl 8 gKCl 0.2 gNa2HPO4 1.42 gKH2PO4 0.27 g（2）向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。（3）滴加浓盐酸将pH值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1 L。（4）高温高压灭菌后，室温保存。注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中补充1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。3. D-PBS是杜氏磷酸缓冲液全称为：Dulbecco's Phosphate Buffered Saline组分 分子量 浓度 (gm/L) 摩尔浓度 (mM)氯化钾 (KCl) 75 0.20 2.67磷酸二氢钾 (KH2PO4) 136 0.20 1.47氯化钠 (NaCl) 58 8.00 138.00磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 142 1.15 8.10pH值为7.4。（1）杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，D-PBS)也是一种磷酸盐缓冲液，与常规PBS的不同之处在于磷酸盐的含量稍低些，并含有钙镁离子。D-PBS主要用于胚胎学方面的研究，多用于胚胎的冲洗液、冻存液和培养液。（2）D-PBS配方：氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，磷酸氢二钠1.15 g，磷酸二氢钾0.2 g，氯化钙0.1 g，含6个结晶水的氯化镁0.1 g溶于1 L ddH2O中。（3）以上配方为含有钙镁离子的D-PBS，如不加氯化钙和氯化镁，即为无钙镁的D-PBS。（4）在以上配方的基础上，还可以加入葡萄糖、丙酮酸钠等，以更利于培养物的生长。D-PBS是杜氏磷酸缓冲液，也是一种磷酸盐缓冲液，与常规磷酸缓冲液最大的不同点在于磷酸盐的含量稍低些，根据是否含钙镁分为两种即D-PBS w/钙 & 镁和D-PBS w/o 钙

1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。2.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。3.加样与洗脱（1）加样量：加样量与测定方法和层析柱大小有关。如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。例如利用凝胶层析分离蛋白质时，若采用28Onm波长测定吸光度，对一根2cm×6Ocm的柱来说，加样量需5mg左右。一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高)，分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5％～10％。样品体积过大，分离效果不好。对高分辨率的分子筛层析，样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定，故高吸水量凝胶如Sephadex G-200，每mL总床体积可加0.3～0.5mg溶质，使用体积约为0.O2倍总体积；而低吸水量凝胶如Sephadex G–75，每mL总床体积加溶质质量为0.2mg，样品体积为0.Ol倍总体积。（2）加样方法：如同离子交换柱层析一样，凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出口，用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时，小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。（3）洗脱：加完样品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连，根据被分离物质的性质，预先估计好一个适宜的流速，定量地分部收集流出液，每组分一至数mL。各组分可用适当的方法进行定性或定量分析。凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液，有时甚至可用蒸馏水。洗脱时用于流速控制的装置最hao的是恒流泵。若无此装置，可用控制操作压的办法进行。样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9～8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。凝胶再生和保存凝胶层析的载体不会与被分离的物质发生任何作用，因此凝胶柱在层析分离后稍加平衡即可进行下一次的分离操作。但使用多次后，由于床体积变小，流动速率降低或杂质污染等原因，使分离效果受到影响。此时对凝胶柱需进行再生处理，其方法是:先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲溶液平衡，即可进行下一次分离。对使用过的凝胶，若短时间保存，只要反复洗涤除去蛋白质等杂质，加入适量防腐剂即可；若长期保存，则需将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥等处理后，装瓶保存。

细胞培养基是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。培养液或培养基的含义几乎相同，英文都是medium。当它是粉剂时，倾向性地称为培养基，而将粉剂配成液体后，多称为培养液。培养液中常常补加血清、抗生素等成分。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。　　一、根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分，可以将培养基分为：天然培养基、合成培养基和半合成培养基。　　1、天然培养基　　天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以较为常用，尤其适合于配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。　　2、合成培养基　　合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。　　3、半合成培养基　　在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。　　二、根据培养基的物理状态来区分，可以分为：固体培养基、液体培养基和半固体培养基。　　1、固体培养基　　在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。在实验室中，它被用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。　　2、液体培养基　　所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。　　3、半固体培养基　　如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.2～1%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。　　三、根据培养基的用途来区分，可以分为：选择培养基、增殖培养基和鉴别培养基等。　　1、选择培养基　　选择培养基利用微生物对某种或某些化学物质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利用所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的，如分离真菌的马丁氏培养基。既有选择作用又有鉴别作用的培养基，如鉴别肠道杆菌的远藤氏培养基。　　2、增殖培养基　　在自然界中，不同种的微生物常生活在一起，为了分离我们所需要的微生物，在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基，这种培养基常用于菌种筛选和选择增菌中。在某种程度上讲，增殖培养基也是一种选择培养基。　　3、鉴别培养基　　鉴别培养基是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与其他中微生物区别开来。主要用于不同类型微生物的快速鉴定，如用来检查细菌能否产生硫化氢的醋酸铅培养基。　　天然培养基　　天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐被合成培养基所替代。　　小牛血清　　用于细胞培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因主要是来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。小牛血清取自出生10～30 天的小牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；胎牛血清应取自剖腹产的胎牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。牛血清中含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。　　血清主要作用　　(1) 提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。　　(2) 提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。　　(3) 提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用　　(4) 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤，对培养中的细胞起到某些保护作用。　　组成及作用　　氨基酸　　组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡[1] 。　　必需氨基酸包括L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸等。　　维生素　　维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源，但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。　　脂溶性维生素如：A、D、E、K。　　水溶性维生素如：B1、B2、B6、B12、泛酸、叶酸、生物素、C、烟酰胺等。　　许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分，没有它们，酶便没有活性，代谢活动将无法进行。　　VA是细胞合成糖蛋白时寡糖基的载体，对上皮细胞有重要的维护作用。VD参与调节钙的吸收。VE是抗氧剂，可防止组成生物膜的磷脂中不饱和脂肪酸被氧化。VK缺乏会引起低凝血酶原及凝血时间延长。　　叶酸是合成四氢叶酸的重要原料，四氢叶酸在核酸的生物合成和蛋白质的生物合成过程中起重要作用。　　生物素是一些特异羧化酶的组成部分，参与糖代谢和脂肪酸的合成过程。　　碳水化合物　　碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。　　无机离子　　钠、钾、镁、钙、磷等基本的无机离子，这些都是细胞组成所必须并参与细胞的代谢。　　培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ?320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。　　Na+是细胞外液中最主要的阳离子，对维持渗透压的恒定有决定性的作用。K+主要分布在细胞内液，细胞内K +的对于激活某些酶是必需的，它在调节细胞内环境的酸碱平衡也有极重要意义。Ca2+ 在细胞外液中的作用是将组织内部细胞之间相互粘着，在细胞内参与许多重要的细胞生理活动，如传导、参与肌肉细胞收缩等。Mg2+ 是构成细胞间质的重要成分，对于细胞间相互稳定结合有很重要的意义。磷的化合物对细胞物质代谢和生理功能调控的功用是十分广泛而不可缺少。

　　细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。　　第一种 细胞凋亡的形态学检测　　根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。　　1 光学显微镜和倒置显微镜　　（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。　　（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。　　2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜　　一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。　　常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。　　Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。　　DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。　　结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。　　3 透射电子显微镜观察　　结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体第二种 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。　　碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。　　方法　　1、 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用 PBS 洗 2 次，加入 100ul Binding Buffer 和 FITC 标记的 Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光 30min，再加入 PI（50ug/ml）5ul，避光反应 5min 后，加入 400ul Binding Buffer，立即用 FACScan 进行流式细胞术定量检测（一般不超过 1h），同时以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为阴性对照。　　2、 贴壁培养的细胞染色：先用 0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。　　3、 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。　　注意事项　　1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。　　2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。　　第三种 线粒体膜势能的检测　　线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。　　线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。　　方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37癈平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。　　注意事项　　1． 始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。　　2． 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。　　第四种 DNA--pian段化检测　　细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。　　1. 大分子染色体DNA--pian段的测定　　细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。因此，细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量大小分开。　　2． DNA Ladder 测定　　方法：收获细胞（1′107），沉淀细胞裂解液13000rpm′5min, 收集上清1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56℃，2h蛋白酶K（2.5mg/ml）37℃，2h?1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4℃过夜?14000rpm′15min，最后将沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer，1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色并照相。　　3． 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析　　方法：收集细胞，70%冷乙醇（in PBS）4℃固定过夜，PBS洗涤，1000rpm′10min，RNase A（0.5mg/ml）37℃消化30min，PI（50mg/ml）染色，室温避光15min，FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。　　4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)　　优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。　　第五种 TUNEL法　　细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。　　由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。　　第六种 Caspase-3活性的检测　　Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。　　1 、Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。　　方法：　　收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4℃过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4℃过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次→ECL显影或NBT/BCIP显色。　　2 、荧光分光光度计分析　　原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。　　方法：收获细胞正常或凋亡细胞，PBS洗涤，制备细胞裂解液，加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物），37℃反应1h，荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。　　3、 流式细胞术分析　　方法：收获细胞正常或凋亡细胞，PBS洗涤，加Ac-DEVD-AMC37℃反应1h，UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。　　第七种 凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析　　TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。）TFAR19蛋白的细胞定位分析　　材料试剂：　　FITC标记的单克隆抗体，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip头，移液器。　　仪器：低温水平离心机, 37℃水浴箱，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜，流式细胞计　　方法：　　1 、悬浮细胞的染色；　　（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。　　（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。　　（3）加入PBS-T溶液，37℃孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。　　（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。　　（5）加入5ml FITC标记的TFAR19单抗（终浓度为1：40），4癈反应30min　　（6）荧光细胞洗液洗2次，1000rpm′10min。　　结果观察：将细胞沉淀滴片，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。　　2、贴壁细胞的原位染色；　　（1） 贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。　　（2） 将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。　　（3） 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。　　3、临床病理切片的染色、检测；　　4、原代细胞的培养、检测；　　5、分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的分布及定位。TFAR19蛋白的表达与临床疾病　　1． ELISA法检测正常人和疾病状态下，以及疾病的不同时期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平。　　材料和试剂：　　1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer　　2. 洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20　　3. 封闭液： 3%BSA（用洗涤液配制）　　4. 酶标抗体的稀释：用封闭液稀释　　5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g 柠檬酸 0.51g DDW 100ml　　6. 显色液（现配现用）：底物Buffer 10ml OPD 2mg  30% H2O2 2ml　　7. 终止液 2Mol/L H2SO48. 重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA Reader（OD490nm），洗板机　　操作步骤　　1. 用包被Buffer稀释的重组人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37℃孵育2h或4℃过夜（一般24h以上）。　　2. 洗涤Buffer洗板三次，加入封闭液，200 ml/well ， 37℃孵育2h或4℃过夜。　　3. 洗涤Buffer洗板三次，加入不同稀释度的病人血清（3个重复孔）100ml/well ，37℃孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对照。　　4. 洗涤Buffer洗板三次，加入1：2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well，37℃孵育1h。　　5. 洗涤Buffer洗板三次，加入显色液，100 ml/well，避光反应10~15min。　　6. 加入H2SO4终止反应，50 ml/well。　　7. ELISA Reader 读取OD490 光密度值，分析和比较病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗体的表达水平。　　2． Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表达水平。

实时荧光定量PCR（Real time PCR）是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，并对起始模板进行定量分析的方法。其涉及领域包括：临床疾病诊断、动物检验检疫、食品安全和科学研究等。在xin型guan状病毒、肝炎、艾zi病、流感、登革热、感染性腹泻等的检测、诊断和治疗上发挥着重要作用。实时荧光定量PCR法可分别为SYBR Green l荧光染料法和Taqman探针法。日常进行核酸检测就是运用Taqman探针法，新guan病毒核酸检测也是利用此项技术。该法高度特异，其核心是利用Taq酶的3’→5’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。在Taqman探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针的5’端标记有报告基团（Reporter，R），如FAM、VIC等，3’端标记有荧光淬灭基团（Quencher，Q），如TAMRA等。当探针完整时，报告基团所发射的荧光被淬灭基团吸收，仪器不能检测信号。随着PCR反应的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’→5’外切核酸酶活性被探针切断，报告基团远离淬灭基团，能量不能被吸收，就产生荧光信号。因此每经过一个循环，荧光信号就和目的片段一样有一个同步指数增长过程。这里涉及基线和CT值的概念。基线是用来确定背景的荧光信号强度的参比对照，相当于PCR指数扩增期以前的荧光强度水平。CT值是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，其由扩增反应体系中模板的初始浓度决定。与传统PCR相比，实时荧光定量PCR有着以下优点：1．检测结果既可以定性，也可以定量；2．检测灵敏度高；3．无需进行凝胶电泳实验，节省实验时间，提高了效率。图1 Taqman探针法工作原理图2 实时荧光定量PCR的几个主要参数

在细胞培养实验中，血清通常作为基础生长培养基的添加剂。而在实验过程中是否选择添加血清，主要根据基础培养基化学成分，培养细胞的类型和培养体系而定。血清的质量大大的影响到实验效果，不少客户在购买时做出疑问：动物血清以何种条件做到质量保证的？一、血清的采集在生产过程中，全血使用无菌一次性塑料袋收集，待凝结后分离，收集和冷冻储存血清。控制初始收集是控制*终血清产品质量的关键因素。只有初始原料符合我们的规范时才能允许生产。二、产品原料的选择在全球市场存在两个胎牛血清标准：美国农业部标准（USDA）和欧洲标准。美国农业部标准，原始血清必须采自未发生疯牛病（BSE）和口蹄疫（FMD）疫情的国家，才可自由进口到任何国家，用于安全生产。而且研究者只有使用符合这种标准的血清，才被允许将其细胞和细胞产品送至其他同样有严格进口条款的国家，进行合作交流。所有上海恒远生物公司胎牛血清均符合USDA标准。三、处理过程严格要求优选数个批次冻存血清进行解冻，检验其内毒素和血红素的含量，满足标准的才能在冷藏条件下充分混合继续加工，进一步进行过滤除菌。上海恒远生物公司依次通过预过滤和膜过滤来处理胎牛血清。*后的过滤步骤为连续三次用100nm的滤膜过滤。过滤结束，血清采用无菌工艺进行分装，整个过程有效确保*终产品无菌。血清生产的空气洁净度为100级。所有分装工作台都通过高效微粒空气过滤器过滤，并保持正压分装环境，对总微粒、悬浮微粒数和压力进行监控。分装后，终产品迅速-20度冻存，并隔离，直到所有的质量控制检测完成。四、FBS质量控制每批血清产品检测确认符合各项标准，并以书面的方式记录在质检报告中。                                                    五、血清质量100%保证生产过程在一个严格控制的条件下进行。紫外线灭菌，过滤除菌和分装是关键生产环节，可以确保血清的品质。与血清生产相关的数据作为专门的档案记录，从初步采集的原料到成品储存的整个生产过程，以及质量控制检测和结果都有备案，并可以在监控条件下追溯源文件。