1.凝胶的预处理
交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒,使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5~10倍的去离子水中,参照相关资料中凝胶溶胀所需时间,进行充分浸泡,然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒,并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡,准备装柱。在许多情况下,也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀,此法不仅能加快溶胀速率,而且能除去凝胶中污染的细菌,同时排除气泡。
2.装柱
层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时,柱床体积应为样品体积的25~100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的4~10倍。柱太短,影响分离效果。柱长一些,分离效果好,但柱太长,则延长分离时间,样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细,会发生“器壁效应”,即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5~1︰25;对于纯化蛋白质来说应为1︰20~1︰100。
凝胶柱的装填方法和要求,基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致,没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后,将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素,或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱,观察色带是否均匀下移,以鉴定新装柱的技术质量是否合格,否则,必须重新装填。
3.加样与洗脱
(1)加样量:加样量与测定方法和层析柱大小有关。如果检测方法灵敏度高或柱床体积小,加样量可小;否则,加样量增大。例如利用凝胶层析分离蛋白质时,若采用28Onm波长测定吸光度,对一根2cm×6Ocm的柱来说,加样量需5mg左右。一般来说,加样量越少或加样体积越小(样品浓度高),分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5%~10%。样品体积过大,分离效果不好。
对高分辨率的分子筛层析,样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定,故高吸水量凝胶如Sephadex
G-200,每mL总床体积可加0.3~0.5mg溶质,使用体积约为0.O2倍总体积;而低吸水量凝胶如Sephadex
G–75,每mL总床体积加溶质质量为0.2mg,样品体积为0.Ol倍总体积。
(2)加样方法:如同离子交换柱层析一样,凝胶床经平衡后,吸去上层液体,待平衡液下降至床表面时,关闭流出口,用滴管加入样品液,打开流出口,使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时,小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。
(3)洗脱:加完样品后,将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连,根据被分离物质的性质,预先估计好一个适宜的流速,定量地分部收集流出液,每组分一至数mL。各组分可用适当的方法进行定性或定量分析。
凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液,有时甚至可用蒸馏水。洗脱时用于流速控制的装置最hao的是恒流泵。若无此装置,可用控制操作压的办法进行。样品体积不宜过多,最好为床体积的1%~5%,最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大,浓度过大粘度大,分离效果差,一般不超过4%。
洗脱液应与膨胀一致,否则更换溶剂,凝胶体积会发生变化,影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02~0.1Mol/L
pH 6.9~8.0的PBS液(0.14Mol/L NaCl)和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液(0.14Mol/L
NaCl)。
凝胶再生和保存
凝胶层析的载体不会与被分离的物质发生任何作用,因此凝胶柱在层析分离后稍加平衡即可进行下一次的分离操作。但使用多次后,由于床体积变小,流动速率降低或杂质污染等原因,使分离效果受到影响。此时对凝胶柱需进行再生处理,其方法是:先用水反复进行逆向冲洗,再用缓冲溶液平衡,即可进行下一次分离。
对使用过的凝胶,若短时间保存,只要反复洗涤除去蛋白质等杂质,加入适量防腐剂即可;若长期保存,则需将凝胶从柱中取出,进行洗涤、脱水和干燥等处理后,装瓶保存。
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