冻干机适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母等的真空冷冻干燥保藏，但不适于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。生物菌种冻干保存步骤，其操作流程如下：　　1、安瓿管准备　　安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。　　2、保护剂的选择和准备　　保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。　　3、冻干样品的准备　　在适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜(以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支)。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。　　4、预冻　　一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。　　5、冷冻干燥　　采用冻干机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。　　终止干燥时间应根据下列情况判断：　　安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；　　真空度接近空载时的最-高值；　　样品温度与管外温度接近；　　选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结；　　选用一个安瓿管，装1-2%氯-化钴，如变深兰色，可视为干燥完结；　　冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。　　6、真空封口及真空检验　　将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。　　7、保藏　　安瓿管应低温避光保藏。　　8、质量检查　　冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。

　　动物细胞培养　　与植物细胞培养和微生物细胞细胞培养相比，动物细胞培养是当中最麻烦的。它需要一些特殊的条件：　　⑴血清：　　动物细动物细胞离体培养需要要到血清，通常使用小牛血清。血清相当于动物细胞离体培养的天然营养液，为动物细胞培养提供像矿物质微量元素、脂肪和激素的生长必需因子。　　⑵支持物：　　很多动物细胞有贴壁生长的习惯。所以离体培养常用的支持物如玻璃，塑料。　　⑶气体调节：　　在细胞培养过程中，需要不断调整二氧化碳和氧气的比例以保持所需要的气体条件。　　植物细胞培养　　⑴光照：　　植物细胞离体培养的营养绝大多数由培养来提供，所有其对光照的条件不是很苛刻。然而光照既和细胞分化相关又和光合作用相关。因此对于　　以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件尤其重要。以植物细胞离体培养方式获得营养，像药物的过程，植物细胞很多都是在反应器中悬浮培养。　　⑵激素：　　生长素能够促进细胞　　远慕生物长期供应的相关产品有：　　①动物血清系列：　　胎牛血清，特级新生牛血清，优级新生牛血清，标准新生牛血清，标准马血清，特级马血清，山羊血清，绵羊血清，兔血清，鸡血清，猪血清，大牛血清，小牛血清，狗血清，驴血清，大鼠血清，小鼠血清，豚鼠血清，巴比西鼠血清。　　②血浆系列：　　胎牛血浆，新生牛血浆，大牛血浆，小牛血浆，兔血浆，马血浆，山羊血浆，绵羊血浆，鸡血浆，猪血浆，狗血浆，驴血浆，大鼠血浆，小鼠血浆，豚鼠血浆。　　③脱纤维全血系列（玻璃瓶和Pet塑料瓶）：　　新生牛血，山羊血，绵羊血，马血，驴血，兔血，兔红细胞（20%），绵羊红细胞（20%），鸡红细胞（20%），兔红细胞（4%），绵羊红细胞4%，鸡红细胞（4%）。　　④抗凝全血系列：　　新生牛血，山羊血，绵羊血，马血，驴血　　⑤裂解全血（脱纤维裂解，抗凝裂解）　　脱纤维裂解血：小牛血，大牛血，山羊血，绵羊血，马血，驴血　　抗凝裂解血：小牛血，大牛血，山羊血，绵羊血，马血，驴血

动物细胞融合也称细胞杂交（cell hybridization），是指两个或多个动物细胞融合成一个细胞的过程，融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。 而动物细胞融合技术最重要的用途是制备单克隆抗体。原理：细胞膜具有一定的流动性

免疫学检测即根据抗原、抗体反应的原理,利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答,在生物体内产生特异性和非特异性T细胞的克隆扩增,并分泌特异性的免疫球蛋白(抗体)。由于抗体-抗原的结合具有特异性和专一性的特点,这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白(抗原或抗体)。免疫学检测技术的用途非常广泛,它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方或双方在某种介质中进行扩散,通过观察抗原-抗体相遇时产生的沉淀反应,检测抗原或抗体,最终达到诊断的目的。这种扩散可以是蛋白的自然扩散,例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验。(1)单向免疫扩散试验(single immunodiffusion test):就是在凝胶中混入抗体,制成含有抗体的凝胶板,将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内,让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散,当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物,出现以小孔为中心的圆形沉淀圈,沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比。(2)双向免疫扩散试验(double immunodiffusion test):一种分析鉴定抗原、抗体纯度和抗原特异性的试验。即抗原和抗体分子在凝胶板上扩散,二者相遇并达到最适比例时形成沉淀线。利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性,可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散。例如:免疫电泳试验和双向凝胶电泳。

植物检测试剂盒原理、使用方法：植物检测试剂盒使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的效果，形成离子束，进入质量剖析器，利用电场和磁场使发作相反的速度色散——离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发作角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子仍然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转效果互相补偿时，它们的轨迹便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发作质量的别离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚集在同一点上，不同质荷比的离子聚集在不同的点上，将它们分别聚集而得到质谱图，然后确认其质量。质谱法还能够进行有用的定性剖析，但对杂乱有机化合物剖析就力不从心了，而且在进行有机物定量剖析时要通过一系列别离纯化操作，非常麻烦。而色谱法对有机化合物是一种有用的别离和剖析办法，特别适合进行有机化合物的定量剖析，但定性剖析则比较困难，因而两者的有用结合将供给一个进行杂乱化合物的定性定量剖析的东西。质谱法特别是它与色谱仪及计算机联用的办法，已广泛使用在有机化学、生化、药物代谢、毒物学、环境保护、石油化学、地球化学、食品化学、植物化学、宇宙化学和国防化学等领域。用质谱计作多离子检测，可用于定性剖析，例如，在药理生物学研讨中能以药物及其代谢产品在气相色谱图上的保留时间和相应质量碎片图为基础，确认药物和代谢产品的存在；也可用于定量剖析，用被检化合物的稳定性同位素异构物作为内标，以取得更准确的成果。远慕生物Elisa试剂盒在无机化学和核化学方面，许多蒸发性低的物质可采用高频火花源由质谱法测定。该电离方式需要一根纯样品电极。假如待测样品呈粉末状，可和镍粉混合压成电极。远慕生物供应各类检测试剂盒。此法对合金、矿藏、原子能和半导体等工艺中高纯物质的剖析特别有价值，有或许检测出含量为亿分之一的杂质。利用存在寿命较长的放射性同位素的衰变来确认物体存在的时间,在考古学和地理学上极有含义。例如,某种放射性矿藏中有放射性铀及其衰变产品铅的存在，铀238和铀235的衰变速率是已知的，则由质谱测出铀和由于衰变发生的铅的同位素相对丰度，就可估量该轴矿藏生成的年代。质谱剖析法对样品有一定的要求。进行GC-MS剖析的样品应是有机溶液，水溶液中的有机物一般不能测定，须进行萃取别离变为有机溶液，或采用顶空进样技术。有些化合物极性太强，在加热过程中易分解。例如有机酸类化合物，此刻能够进行酯化处理，将酸变为酯再进行GC-MS剖析，由剖析成果能够推测酸的结构。假如样品不能汽化也不能酯化，那就只能进行LC-MS剖析了。进行LC-MS剖析的样品是水溶液或甲醇溶液，LC活动相中不该含不蒸发盐。Elisa试剂盒对于极性样品,一般采用ESI源，对于非极性样品,采用APCI源。

　　动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。　　细胞培养基的种类有哪些？　　按照细胞培养基的发展历史，细胞培养基大致可分为平衡盐溶液、天然细胞培养基、合成细胞培养基、无血清细胞培养基、限定化学成分细胞培养基等几大种类。　　1.DMEM细胞培养基　　DMEM（Dulbecco’s modified Minimal Essential Medium）是由Dulbecco在MEM培养基的基础上改良获得的，各成分份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L）两种类型。细胞生长快。附着稍差的肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好，常用于杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养。　　2.神经元基础培养基　　可为神经元生长提供基础营养物质。　　3.IPL-41 昆虫培养基　　IPL-41昆虫培养基（IPL-41 Insect Medium）旨在用于大规模扩增草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞系，也常用于通过杆状病毒表达系统（BEVS）进行蛋白表达。 IPL-41培养基是对原始IPL配方的改良，由美国农业部昆虫病理实验室Weiss等人开发，用于大规模扩增草地贪夜蛾衍生细胞系。Weiss向基础培养基中加入了胎牛血清和TPB培养基（Tryptose Phosphate Broth），成功地实现了IPL-21 AE (III)细胞系的大规模连续培养。　　该培养基主要用于培养和维护鳞翅类衍生细胞系和扩增这些细胞系的病毒。IPL-41培养基基础也以用于无血清夜蛾细胞的杆状病毒重组蛋白表达。　　1.1 平衡盐溶液（balanced salt solution，BSS）　　BSS主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。其主要用于细胞的漂洗、配制其他试剂等。　　目前用于细胞培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。　　1.2 合成细胞培养基　　合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。最早开发的基础培养基（minimal essential medium, MEM），其本质为含有盐、氨基酸、维生素和其他必需营养物的pH缓冲的等渗混合物。在此基础上，DMEM、IMDM、HAM F12、PRMI1640等各种合成细胞培养基被不断开发出来。

　　动物细胞培养基有平衡盐溶液、天然培养基、合成培养基、无血清培养液等四种。　　平衡盐溶液：　　目前常用的平衡盐溶液有乳酸钠和复方氯化钠溶液（1.86%乳酸钠溶液和复方氯化钠溶液之比为1:2）与碳酸氢钠和等渗盐水溶液（1.25%碳酸氢钠溶液和等渗盐水之比为1:2）两种。　　天然培养基：　　天然培养基也称复合培养基，是含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物。　　天然培养基主要取自动物体液或从动物组织分离提取。其优点是营养成分丰富，培养效果良好，缺点是成分复杂，来源受限。　　合成培养基：　　合成培养基（synthetic medium），又称为组合培养基，是通过顺序加入准确称量的高纯度化学试剂与蒸馏水配制而成的，其所含的成分（包括微量元素在内）以及他们的量都是确切可知的。合成培养基一般用于实验室中进行的营养、代谢、遗传、鉴定和生物测定等定量要求较高的研究。　　无血清培养液：　　无血清培养液是不含血清而含有支持细胞增殖和生物反应的多种营养成分（如生长因子、组织提取物等）的细胞培养液。　　无血清培养液由基础培养液和附加成分组成，取代血清的补充物：　　1、激素和生长因子；　　2、结合蛋白类；　　3、低分子量营养因子；　　4、贴壁和铺展因子等。

一、试剂间化学污染的来源全自动生化分析仪发展迅速，具有多项目、多样本的处理能力，检测速度不断的提高，但由于共用吸样针、试剂针、搅拌棒以及比色杯，当生化仪长期使用致其清洗能力下降、比色杯老化后引起吸附力增加、生化仪内污垢的积聚、测试顺序安排不当，且常规清洗不能有效消除交叉污染时，就会增加试剂间化学污染的可能性，引起测定结果不准确。１.试剂针污染：目前大多数全自动生化分析仪采用双试剂检测样本，，试剂Ｒ１、Ｒ２的吸取与吐出，一般分别只配有一套试剂针。当试剂针在清洗不完全，或黏附力增加时，残留试剂可能会对下一相临检测结果造成影响。２.搅拌棒污染：在试剂与样本混合后，往往需要搅拌棒加以混匀，而搅拌绑若清洗不完全，或黏附力增加时，残留试剂可能会对下一相临检测结果造成影响。３.比色杯污染：生化分析仪的比色杯一般是循环使用的，每个比色杯检测完毕后，进行清洗，然后继续下一个检测项目的检测。当某个比色杯清洗不完全时，吸附在比色杯上的上一个项目的残留试剂，可能会对在这个比色杯中进行的下一个项目的检测结果造成影响。以上３种可能的污染，以比色杯污染最为严重，因此比色杯最难以清洗干净，且在实际工作中难以判断该比色杯上一测试的项目；试剂针吸量较大，亦难以清洗干净。二、试剂间化学污染的类型试剂间化学污染的原因很多，常见的类型主要有以下几种：１.试剂成分的直接污染：上一测定试剂中含有下一测定所需要测定的物质，直接干扰下一检测的测定结果。如：AMY试剂中含有较高浓度的Ca2+ ；ALP（IFCC法）、CK（NAC法）、CK-MB（NAC法）、CO2（PEPC法）、AMY（EPS法）、TG等试剂中含有Mg2+；GLU（氧化酶法）、TP、ACP试剂中含有较高浓度的K+；ChE、CHOL、GLU（GOD法）、UA（尿酸酶法）、LDH（IFCC法）、HBDH（DGKC法）等试剂中含有磷酸缓冲液；CHOL、TG、HDL-C试剂中含有胆酸钠；AST（IFCC法）、ALT（IFCC法）、试剂中含哟高活性LDH；以上试剂的交叉污染就会分别对Ca2+、Mg2+、K+（紫外酶法）、P、TBA、LDH的测定结果造成干扰。２.试剂成分参与反映：上一个试剂中含有的某种试剂成分与下一反应所要测定的底物有作用，因而干扰下一反应的测定结果。如：（1）镁测定试剂的络合剂亦能与铁结合，影响铁有铁络合剂的结合；（2）直接胆红素（重氮法）试剂含EDTA，镁试剂中含有EGTA，均能与Ca结合，从而Ca的测定；（3）以甘油作为酶保护剂的试剂，回对TG的测定带来干扰；（4）钙（MTB法）试剂对钾有负干扰；（5）CHOL试剂中含有胆固醇酯酶，可水解胆固醇酯形成游离胆固醇，而引起对游离胆固醇测定的干扰。３.反应进程相同：上一试剂所引导的反应对下一个项目的反应进程带来间接的干扰，下一项目所测定的是前后两个项目反应的综合作用结果。如：（1）当上一个反应产物为H2O2时则对以Trinders反应产生颜色的测定结果引起干扰。如UA对CHOL结果的影响；CHOL对CREA（酶法）测定结果的影响；GLU（氧化酶法）对CREA测定结果的影响。（2）CK（NAC法）、CK-MB（NAC法）试剂中含GLU成分，其分析方法的原理中GLU的已糖激酶（HK）反应过程，因此可能对GLU的测定带来干扰。４.影响反映条件：影响下一项目的反应条件如pH等，从而改变反应速率。如：（1）直接胆红素（钒酸盐氧化法）试剂中含有表面活性剂的酒石酸盐缓冲液会影响ALT活性，对测定结果有负干扰。（2）CREA（苦味酸速率法）反应条件为碱性，果糖胺（动力学法）反应条件为酸性，受到污染后反应速率会减慢。（3）CREA（酶法）史试剂中含有抗坏血酸氧化酶，影响了氧化还原反应的进程，回对 TBA（酶循环法）测定结果有影响。三、试剂间化学污染的判别由于试剂中化学成分非常复杂，各种稳定剂、反应物质、缓冲体系共存，且各品种、各厂商的试剂内含物均不同，因此时机间的化学污染往往较难判别。日常工作中往往是仪器评估没问题，而用户使用时存有污染；质控品和Westgard法则不起作用，质控往往在控；污染具有偶然性，并不是每次都出现。这就导致了判别此类污染的困难性。当按照日常的分析顺序出现异常结果时，将出现异常结果的分析项目及其前一个项目单独复检又恢复正常，多是由于发生试剂间交叉污染所致。但由于试剂成分的复杂多样性，仪器状况的独特性，可能发生的试剂间交叉污染的情况不尽相同。各个公司所提供的产品说明书长不能够全面的反映试剂组成的情况，因此需要通过试验才能发现试剂交叉污染可能带来的干扰。一般可以用以下试验来加以判别：１.将某一试剂作为样本进行全套项目测定，观察各项生化结果的情况，进而确定发生试剂交叉污染时造成直接干扰的项目。２.一份样本分成两份，一份加生理盐水或其他适当的稀释液，另一份加等量的某试剂，同时测定，观察结果的变化，进而确定发生试剂交叉污染时造成直接干扰的项目。３.试剂交叉污染试验方法：（1）交叉污染初试：假设有3个项目 A，B，C，以一混合血清作为标本，按以下顺序测试：A，A，A，A，A，B，A，C，A，B，B，B，B，B，C，B，C，C，C，C，C。得到的结果分别为：A1，A2，A3，A4，A5，BA-B，AB-A，CA-C，AC-A，B1，B2，B3，B4，B5，CB-C，BC-B，C1，C2，C3，C4，C5（AB-A：表示B项目对A项目污染时A项目的测定值，其余表示类同）。以A2-A5、B2-B5、C2-C5的4次测定平均值分别作为A、B、C项目无污染时的测定值。若（AB-A/A×100%）105%则强烈支持B试剂对A有交叉污染。(2)疑似污染确认：若上述初试验结果B对A有污染，则可进行以下试验进行确认，测定顺序为：B,A,A,A,结果为：B，A1，A2，A3。若（A1/A3×100%）105%，则强烈支持B对A有交叉污染。A1→A3的结果可观察受B污染的程度是否逐渐减轻。四、消除试剂间化学污染的方法１.要求检验人员对仪器工作流程、试剂组成、测定原理要了如指掌，对试剂交叉污染的各种可能性加以考虑，合理设计程序。更换试剂时应仔细研究说明书，发现和避免可能存在的试剂交叉污染。２.当发现有交叉污染时，应对仪器进行保养，如更换比色杯、管道，用无水乙醇擦洗试剂针和搅拌棒，检查清洗装置及效果等。３.合理安排检测项目的顺序，在有交叉污染的检测项目中间插入一个或两个非污染项目。最彻底的做法则是将被干扰项目置于干扰项目之前，以消除干扰发生的可能。由于各个感厂商试剂盒原理不同，内含成分不同，故无固定的测定顺序格式，需要自己摸索。一般检测顺序有以下原则：（1）不受上一试剂的干扰；（2）不影响下一试剂测定；（3）不影响测试速度；（4）充分运用剩余试剂位开展新项目；（5）利用好仪器的功能。４.当合理设置测试顺序无法消除交叉污染时，可使用生化仪的试剂针、比色杯清晰程序，对试剂针、比色杯进行2次或多次清洗。用碱性清洗掖及酸性清洗掖冲洗试剂针可以有效地避免携带污染。５.选用具有抗交叉污染的试剂盒：如在游离胆固醇试剂中添加胆固醇酯酶抑制剂，以减少胆固醇酯酶水解胆固醇酯而引起对游离胆固醇测定的污染。实际工作中，用全自动生化分析仪进行连续的多个项目的测定，每个反应的详细过程难以探知，特别是比色杯的交叉污染无明显的特征，因此应理论分析结合实际应用摸索出一套符合本单位的方法

在免疫学实验中，通常使用封闭剂来减少非特异性结合。常用的封闭剂有脱脂奶粉，BSA，血清以及 Fab 片段单链二抗等。根据不同的平台选择相应的封闭剂。脱脂奶粉作用原理：脱脂奶粉含有多种蛋白，可以封闭未吸附蛋白的固相载体（WB 膜、ELISA 板等）位点，减少抗体与之结合的概率，避免非特异性结合带来的高背景。优点：价格便宜，因含多种不同分子量的蛋白，故封闭起来更全面。缺点：成分复杂，适用范围窄。不适用于生物素和碱性磷酸酶标记的抗体系统。且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的生产中较少应用。牛血清白蛋白BSA作用原理：同脱脂奶粉，封闭未吸附蛋白的固相载体位点。优点：成分单一，适用于 ELISA 实验，生物素、碱性磷酸酶系统的免疫学检测实验或者其他对特异性要求较高的实验。缺点：大部分 BSA 中有少量的抗体残留，会导致抗原/抗体之间的交叉反应，造成一定背景。动物血清作用原理：1、待检样本会有些与蛋白非特异性结合的物质，从而导致背景过高，因此可以用血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，血清和 BSA 没有明显区别；2、待检样本中可能会有 Fc 受体，可以和抗体恒定区结合，而封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本 Fc 受体之间结合。BSA 则无法封闭 Fc 受体。优点：因为血清可以封闭 Fc 受体及减少抗体间的非特异性结合，故在免疫组化、免疫荧光实验中有广泛应用。缺点：某些封闭血清中可能含有叠氮钠，因此不适用于 HRP 酶标的检测体系。Fab 片段单链二抗作用原理：由于二价的抗体（全 IgG 或 F（ab’）2 片段）有两个结合位点，不能用来封闭。而 Fab 片段单链二抗只有一个结合位点，因此可完全封闭免疫球蛋白。应用：在 IHC 或 IF 双标/多标实验中，封闭样本表面的免疫球蛋白，封闭组织切片或细胞表面的内源性免疫球蛋白，并可解决两个一抗来自同一种属的麻烦。无蛋白封闭剂---新型高效封闭剂Blocker 无蛋白封闭剂，该封闭剂是通过化学合成高亲水性化合物，不存在生物封闭剂所担心的生物安全性、质量、批间差等问题。主要特点：1）与微球表面活化的羧基偶联形成稳定的共价键2）纯化学合成，批间差小，纯度高3）空间结构简单，更充分的封闭微球表面，降低微球非特异性吸附，减少基质干扰4）提高试剂灵敏度5）含大量亲水基团，有利于提高试剂稳定性应用领域：乳胶免疫比浊试剂/ 化学发光试剂 ，代替 BSA 作为封闭剂或与 BSA 联合封闭。免疫试剂稳定液免疫试剂稳定液主要用于免疫分析检测试剂/抗原/抗体/蛋白的保存.  该产品属于即用型，无需稀释，使用简单方便，将待保存物质溶于稳定液中后置于冰箱即可。免疫试剂稳定   液有利于维持蛋白的三维结构，保持蛋白的生物活性，可延长免疫分析试剂及蛋白的使用期限，确保产品的性能。应用领域:1）免疫分析试剂保存, 如免疫比浊检测试剂/化学发光检测试剂2）蛋白质保存，如抗原/抗体/酶类等

菌种的遗传特性需要在一定条件下才能表现出来。由于培养条件不适当，使菌种处于不利于发酵生产的生理状况，其结果也表现为菌种衰退。菌种处于不利于发酵的生理状况有以下三个方面的原因。① 一个菌种不是纯的群体，而是由一些变异株混合组成，这些变异株所占的比例决定该菌种的特性。一个由单菌落发育而来的菌种在固体培养基上分离，可以长出许多种形态培养特征的菌落。这些不同的菌落类型在代谢和生长繁殖速度等方面有一定差异。培养条件可以影响各变异株在培养物中的比例而改变该菌种的特性。同一个菌种的单孢子分离在不同的培养基上，所生长出的单菌落，其形态培养特征有显著差异，各种类型菌落所占的比例也不同。如灰色链霉菌(Streptomyces griseus)在豌豆琼脂培养基上，单孢子分离呈现出3～4种菌落类型，而在黄豆粉培养基上仅出现两种菌落类型。在开始菌种选育工作时，要研究单菌落的分离培养基，找出能呈现较多菌落类型的分离培养基。菌落类型和发酵产量之间存在着某种程度的相关性。在选种实践中，人们经过对菌落形态的考察，有意识地丢弃一些被认为是低产的菌落，挑选那些可能是高产的菌落。② 菌种培养基可通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。菌种培养基营养过于丰富不利于孢子形成，因而影响发酵。菌种培养基营养贫乏也同样不利于发酵。因为菌种在营养贫乏的培养基中多次传代，会使菌体细胞内缺乏某些生长因子而衰老甚至死亡。因此，自然选育或菌种培养所用的培养基应选择具有菌种传代后生产能力下降不明显、菌体不易衰老和自溶的正常形态菌落、孢子丰富的培养基。③ 在某些培养条件下，菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态，而使菌种的生理状态改变。这种改变可能以类似于生理性迟延或细胞分化的机制保持较长一段时间。由于菌种的衰退将会引起发酵过程的产量急剧下降，一旦发生菌种衰退，就必须采取有效的预防和防治措施，防止菌种的优良性状发生退化。同时若发现某些优良性状退化，应及时进行分离纯化，使生产菌种保持稳定的优良特性。防止菌种衰退的措施主要有菌种的复壮、提供良好的环境条件、定期纯化菌种、防止自身突变等各个方面。

 现在较常用的质粒提取方法有三种:碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法，前两种方法较为剧烈，适用于较小的质粒（＜15Kb），而去污剂裂解法则比较温合，一般用于分子量较大的质粒（＞15Kb）。 碱裂解法是一种广泛使用的制备质粒DNA的方法。其原理为：染色体DNA远远大于质粒DNA，染色体DNA为线状分子，而质粒为共价闭合环状分子。当pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子的染色体DNA完全变性，而共价闭环质粒DNA在将PH调至中性后即可以恢复其天然构象，在高盐浓度存在的条件下，染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA仍在上清中。 质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸分子。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制。(Vector)(DNA) 目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是共价闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。 质粒提取原理现在较常用的质粒提取方法有三种:碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法，前两种方法较为剧烈，适用于较小的质粒（＜15Kb），而去污剂裂解法则比较温合，一般用于分子量较大的质粒（＞15Kb）。碱裂解法是一种广泛使用的制备质粒DNA的方法。其原理为：染色体DNA远远大于质粒DNA，染色体DNA为线状分子，而质粒为共价闭合环状分子。当pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子的染色体DNA完全变性，而共价闭环质粒DNA在将PH调至中性后即可以恢复其天然构象，在高盐浓度存在的条件下，染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA仍在上清中。 质粒提取常见问题分析1、影响质粒提取的因素有哪些？质粒提取的得率和质量与很多因素有关，如宿主菌的种类和培养条件、细菌细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟练程度等等。 2、为什么从革兰氏阳性菌中提取质粒要在悬浮液中加入溶菌酶？革兰氏阳性菌有一层细胞壁，必须加入溶菌酶才能使之溶解。 3、如何根据实验需要选择不同级别的产品？从纯度上：各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化，普通纯度的质粒可以满足要求；而对于转染实验，则要求使用高纯度质粒提取试剂盒方能满足要求。从提取的量上：1-20μg，应选择小量提取试剂盒；20-40μg，应选择中量提取试剂盒；大于40μg，应选择大量提取试剂盒。从宿主菌上：分为普通细菌质粒提取试剂盒、G+菌质粒提取试剂盒和酵母菌质粒提取试剂盒，根据情况进行选择。

　　1、生物效应是瞬时的　　通过对体内活性蛋白前体的激活而迅速表现出活性。因为无需通过基因复制转录及表达等复杂的过程，所以能迅速对外界信号作出反应。此外这种反应又是定向而不可逆的，不同于体内其他一些酶的生物调控机制，例如一些磷酸化激酶，通过对蛋白质的磷酸化及去磷酸化使产生变构效应，从而进行可逆的生物调控。　　2、以级联反应的方式表达　　即在第一级反应中被激活的蛋白质,本身就是催化下一级反应的蛋白酶,这样就起着逐级放大的作用。例 2如一分子酶即使以很低的水平催化1000个分子底物反应，经两级催化反应后就放大了100万倍,因而机体对微弱的外界信号也能产生很强的生物效应。　　3、存在正负反馈系统　　从而使整个多级反应体系处于最佳状态，例如在血凝过程中被激活的凝血酶既能催化血纤维蛋白原使之转变为血纤维蛋白，又能激活凝血因子Ⅷ及Ⅴ，后者又进一步促进凝血酶原的激活，这是正反馈，但凝血酶又能自身降解凝血酶原，使之不能再被激活，这是负反馈。　　在催化同一活性蛋白前体时有时能产生两种或两种 以上生物功能各不相同的组分　　例如促肾上腺激素、β-促脂肪激素及内啡肽都由同一前体蛋白水解产生。　　参与生物调控的蛋白酶有时可通过两种不同途径产生同一生理效应，彼此间起到一定的互补作用。例如凝血反应中既有血液中的内源性激活系统，又有组织中的外源性激活系统,两者最后都通过凝血因子X使凝血酶原激活。　　在蛋白酶所参与的一些重要生物调控体系中几乎毫无例外都有相应的蛋白酶抑制剂存在。若在某些体系中蛋白酶与其相应抑制剂的平衡失调，就会引起病变。例如先天性静脉血栓和血管神经性浮肿往往是与体内缺乏相应的抗凝血酶抑制剂Ⅲ及补体C1抑制剂有关。

1. 取过夜菌至50毫升离心管内，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清，再倒入约50毫升菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过150毫升，对于低拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过200毫升。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。2. 每管加入5毫升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。确认溶液I中已添加了RNase A。最高速度vortex 10-20秒或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开，或手指把沉淀弹开。3. 每管加入5毫升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，室温放置1-2分钟，使细菌完全裂解，溶液透明。切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后，溶液应变得透明，无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，再室温放置2-3分钟，但总裂解时间不可超过5分钟。4. 每管加入7毫升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致最终所得质粒的质量下降。5. 12,000-14,000rpm)室温离心10分钟。如果离心机的最高速度较低，需要适当延长离心时间，例如约5000-6000rpm时需要离心20-30分钟或更长时间，直至沉淀充分。离心时可以准备好质粒纯化柱，自制漏斗等，并在纯化柱上标上记号。6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。12,000-14,000rpm离心2分钟，倒弃收集管内液体。质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。本步骤及后续需要12,000-14,000rpm离心2分钟的步骤，如果离心机的最高速度较低，需要适当延长离心时间，例如约5000-6000rpm时需要离心约5分钟或更长时间，直至液体全部穿柱。如果离心后有少量漂浮物，可以考虑再次离心，或者使用擦镜纸两次对折后打开形成的自制漏斗，以过滤去除漂浮物。7. 在质粒纯化柱内加入12毫升溶液IV，12,000-14,000rpm离心2分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体。加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。8. 12,000-14,000rpm再次离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。9. 将质粒纯化柱置于50毫升离心管上，加入2毫升溶液V至管内柱面上，放置2分钟。也可以用重蒸水或MilliQ级纯水替代溶液V，但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。如想得到较高浓度的质粒，可以加入1毫升溶液V洗脱，质粒得率实测减少约5-10%，具体减少量与特定样品有关。10. 12,000-14,000rpm离心2分钟，所得液体即为转细胞级超纯质粒。通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml左右，可以用于细胞转染。如果想得到高浓度的质粒，可以采用如下的异丙醇沉淀方法浓缩质粒或常规的乙醇沉淀方法。a. 加入0.7倍体积的常温异丙醇(例如1毫升待浓缩质粒中加入0.7毫升异丙醇)，混匀后1,2000-14,000rpm 4℃离心10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀。如果希望获得较高浓度的质粒，在洗脱时推荐采用1毫升洗脱液进行洗脱，后续可以转移到2毫升离心管内进行异丙醇沉淀，这样操作起来相对比较方便。异丙醇沉淀的DNA为玻璃状近透明的颗粒状沉淀，和乙醇沉淀产生的含盐沉淀物相比较难观察清楚。离心后取放离心管要尽量轻柔，避免沉淀松动或部分颗粒状悬浮至溶液中。不推荐直接倒弃上清，直接倒弃上清时经常出现直接把质粒沉淀倒掉的情况；如果偏好直接倒弃上清，建议把上清倒弃至一洁净离心管内，这样万一沉淀被倒出，仍然可以从洁净离心管中回收。推荐用移液枪吸去上清，并注意尽量避免吸走沉淀。b. 加入1毫升常温70%乙醇溶液，轻轻悬起质粒沉淀以充分洗涤，12,000-14,000rpm 4℃离心5-10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀。c. 5,000-10,000rpm 4℃离心5-10秒，用20微升或200微升移液器小心吸净残留液体，避免触及沉淀。d. 肉眼观察无明显液体后(吸净液体后通常在1分钟内即可完成干燥)，加入适当体积的溶液(如溶液V、10mM Tris-Cl pH8.5或Milli-Q级纯水)溶解DNA。DNA样品不能过于干燥，否则很难溶解。最好在弱碱性条件下溶解DNA，溶解时可用缓冲液反复冲洗管壁，使管壁上的DNA充分溶解。附表1. EndA- and EndA+ strains of E. coli.EndA- EndA+BJ5183 BL21(DE3)DH1 CJ236DH20 HB101DH21 JM83DH5α JM101JM103 JM110JM105 LE392JM106 MC1061JM107 NM522 (all NM series are EndA+)JM108 NM554JM109 P2392MM294 PR700 (all PR series are EndA+)SK1590 Q358SK1592 RR1SK2267 TB1SRB TG1TOP10 Y1088 (all Y10 series are EndA+)XL1-Blue BMH 71-18XLO ES1301

1.什么是pH标准缓冲溶液？它有哪些特点？pH缓冲溶液是一种能使pH值保持稳定的溶液。如果向这种溶液中加入少量的酸或碱，或者在溶液中的化学反应产生少量的酸或碱，以及将溶液适当稀释，这个溶液的pH值基本上稳定不变，这种能对抗少量酸碱或大或稀释，而使pH值不变化的溶液就称为缓冲溶液。pH标准缓冲液有以下特点：（1）标准溶液的pH值是已知的，并达到规定的准确度；（2）标准溶液的pH值有良好的复现性和稳定性，具有较大的缓冲容量，较小的稀释值和较小的温度系数；（3）溶液的制备方法简单；2.如何配制pH标准缓冲溶液？对于一般pH测量，可使用成套的pH组冲试剂（可配制250mL），配制溶液时，应使用去离子水，并预先煮沸15～30分钟，以除去溶解的二氧化碳。剪开塑料袋将试剂倒入烧杯中，用适量去离子水使之溶解，并冲洗包装袋，再倒入250mL容量瓶中，稀释至刻度，充分摇匀即可。3.如何正确保存和使用pH缓冲溶液？缓冲溶液配制后，应装在玻璃瓶或聚乙烯瓶中（碱性pH缓冲液，如，pH=9.18、pH=10.01、pH=12.46等，应装在聚乙烯瓶中）瓶盖严密盖紧，在冰箱中低温(5～10℃)保存，一般可使用六个月左右，如发现有混频器浊，发霉或沉淀现象，不能继续使用。使用时，应准备几个50mL的聚乙烯小瓶，将大瓶中的组冲溶液倒入小瓶中，并在环境温度下放置1～2个小时，等温度平衡后再使用。使用后不得再倒入大瓶中，以免污染，瓶中的缓冲溶液在＞10℃的环境条件下可以使用2～3天，一般pH=7.00、pH=6.86、pH=14.00三种溶液使用时间可以长一些，pH=9.18和pH=10.01溶液由于吸收空气中的二氧化碳，其pH值比较容易变化。4.pH缓冲溶液有何用途？（1）pH测量前标定校准pH计。（2）用以检定pH计的准确性，例如，用pH=6.86和pH=14.00，标定pH计后，将pH电极插入pH=9.18溶液中，检查仪器显示值和标准溶液的pH值是否一致。（3）在一般精度测量时检pH计是否需要重新标定。pH计标定并使用后也许会产生漂移或变化，因此在测试前将电极插入与被测溶液比较接近的标准缓冲液中，根据误差大小确定是否需要重新标定。（4）检测pH电极的性能。

一. 目的学习用浓盐法从酵母中提取RNA掌握用等电点法沉淀RNA观察核酸的颜色反应，了解核酸定性与定量测定的原理熟练掌握普通离心机的使用方法二. 原理酵母繁殖快，生长周期短；其细胞质中的核酸大部分是RNA，而DNA很少；RNA提取液与菌体分离比较容易。因此，酵母是提取RNA的好材料。将RNA从细胞中释放出来在工业上主要有三种方法—稀碱法、浓盐法和自溶法。本实验采用浓盐法，即利用高浓度的盐（10% NaCl）在90～100°C条件下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成RNA和蛋白质而使 RNA释放到盐溶液中。同时，90～100°C的高温可破坏磷酸单酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA的降解。注意，在30～70°C时这两种酯酶的作用活跃，提取时应避免在此温度范围内停留时间过长。由于核膜内的DNA分子量较大，穿越膜孔较困难，一般不易释放到菌体外面，所以采用离心技术，可使RNA 溶液与菌体残渣以及DNA分离。根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将溶液在低温下调pH至2.0～2.5，RNA以白色絮状沉淀形式从盐溶液中析出。再次离心，固液分离，便可获得RNA粗产品。最后用乙醇洗涤沉淀，溶解和去除脂溶性杂质和色素以及盐分杂质。由于RNA不溶于乙醇，所以用乙醇洗涤还可以使RNA沉淀物脱水，变得疏松，便于干燥，提高了RNA产品的纯度。DNA和RNA的鉴别，较常用的方法是利用两类核酸中不同的戊糖各自具备的不同的颜色反应，而得以定性鉴别。其中鉴定DNA的方法称为二苯/胺法，鉴定RNA的方法称为地衣酚（苔黑酚，3,5-二羟甲/苯）法。具体反应式如下：三. 实验材料及设备1. 材料干酵母2. 仪器离心机电子天平 沸水浴烘箱 抽滤装置 冰浴3. 器材普通试管： 20mL×4（干燥）锥 形 瓶： 100mL×1量 筒： 50mL×1移 液 管： 1mL×2烧 杯： 250mL×1 100mL×1 50mL×1离 心 管： 100mL×1温 度 计： 50℃×1表 面 皿： f9cm滴 管： 2洗 耳 球： 2加 样 器pH试纸： pH0.5～5.0滤 纸： f7cm洗瓶、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：各1四. 试剂的配制1. NaCl溶液（C.P.）（10%）2. HCl溶液（6N）取500mL浓盐酸，用水稀释至1000mL。3. 乙醇（C.P.）（95%）4. 苔黑酚试剂（又称地衣酚试剂）将200mg苔黑酚溶于 100mL浓盐酸中，再加入100mg FeCl3·6H2O。（低温贮藏一周）5. 二苯/胺试剂将1g二苯/胺溶于98mL冰醋/酸中，再加入2mL浓硫酸（比重1.84）。（临用时配制，用前可加几滴乙/醛。）五. 操作步骤1. 取材在天平上准确称取干酵母3.00g，转移至100mL锥形瓶中。2. 浓盐浸提取 27mL 10%NaCl溶液，加入到含干酵母的锥形瓶中，搅拌均匀；置于90～100°C水浴中，浸提30～60分钟；冷却。3. 离心将锥形瓶中提取液和沉淀全部转移至100mL离心管中，取10mL H2O洗涤锥形瓶，并入离心管中；平衡后以4000转/分钟离心 15分钟；将上清液（即RNA提取液）倾入50mL烧杯中，弃去沉淀（菌体残渣）。4. 沉淀RNA(1) 冷却：将50mL烧杯置于放有冰块的250mL烧杯中冷却；将温度计插入50mL烧杯中，待溶液冷至10°C以下时，取出温度计。(2) 调pI：缓慢滴加 6NHCl于50mL烧杯中，用玻棒一边轻轻搅拌溶液，一边测量pH值，调节溶液pH至2.0～2.5范围，溶液中白色沉淀逐渐增多，到等电点时沉淀量最多；继续在冰浴中静止15分钟，使沉淀充分。（注意：①严格控制pH；②若搅拌过快核酸难以凝聚沉淀。）5. 离心将小烧杯中溶液和沉淀移至离心管中，再次平衡、离心（4000转/分钟，15分钟）；弃去上清液，保留RNA沉淀。6. 洗涤与抽滤(1) 洗涤：取10mL 95%乙醇加到含RNA沉淀的离心管中，悬浮沉淀，浸泡5分钟。(2) 抽滤：取大小合适的滤纸，先在数字显示天平上称重；然后放入布氏漏斗中，用少量乙醇湿润滤纸，开启真空泵，使滤纸贴紧漏斗，将沉淀及溶液全部转移至布氏漏斗内；再用15mL 95%的乙醇洗涤离心管，淋洗滤渣。7. 干燥用小镊子取出布氏漏斗中的沉淀物和滤纸，转移至表面皿上，置于80°C烘箱内干燥。8. 称重取出样品，在室温下冷却数分钟后，将沉淀物及滤纸置于数字显示天平上称重。9. 颜色反应(1) 溶解：取50mL水溶解RNA沉淀，同时加2滴NaOH助溶。颜色反应：取4支洁净、干燥的试管，按下表所示顺序操作六. 结果处理 1. 写出核酸产品的颜色和外形。 2. 计算RNA的粗产品的得率。 3. 由颜色反应的结果，说明产品中含有核酸的情况。

蛋白质的提取工作是将经过处理或破碎的细胞，置于一定的条件和溶液中，让被提取物充分释放出来的过程。影响提取的因素主要是被提取物质在提取的溶液中溶解度的大小及由固相扩散到液相的难易程度。某一物质在溶剂中溶解度大小与该物质的分子结构及溶剂理化性质有关，一般遵守“相似相溶”的原则。扩散作用对蛋白质的提取有一定的影响。减小溶剂的黏度、搅拌和延长提取时间可以提高扩散速度，增加提取效果，提取的原则是“少量多次”，即对于等量的提取溶液，分多次提取比一次提取效果好得多。大部分蛋白质都可以溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中，因此，可采取不同溶剂提取分离和纯化蛋白质。一、水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1～5倍，提取时需要均匀地搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度视其有效成分的性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此基于这一点考虑，提取蛋白质时一般采用低温（5℃以下）操作。为了避免蛋白质提取过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸、碘/乙酸等）。下面着重讨论提取液的 pH 和盐浓度的选择。1. pH 蛋白质是具有等电点的两性电解质，提取液的 pH 应选择在偏离等电点两侧的 pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或者过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆化。一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。2. 盐浓度 稀盐溶液可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量 NaCl等中性盐，一般以0.15mol/L浓度为宜。缓冲液常采用0.02～0.05mol/L磷酸盐或碳酸盐的等渗盐溶液。二、有机溶剂提取法一些和脂类结合比较牢固或者分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮或丁醇等有机溶剂，它们具有一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想的提取脂蛋白的提取液，但必须要在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂类结合紧密的蛋白质特别优越，一方面是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；另一方面，丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起蛋白质的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。三、蛋白质提取举例——胰糜蛋白酶的制备【实验目的】掌握从组织中制备胰糜蛋白酶的原理和方法。【实验原理】胰糜蛋白酶是胰腺产生的一种消化酶。最初以酶原的形式被合成与分泌，之后在胰蛋白酶的作用下被水解而激活。胰糜蛋白酶是一种催化肽键的肽链内切酶，主要切断色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的羧基侧肽键。酶绝大多数都是蛋白质，因此一般提纯蛋白质的方法也适用于酶的提纯，所不同的是在提纯酶的过程中要不断地进行酶活力的检测，本实验主要涉及提取过程。【实验药品与器材】（一）材料和试剂1. 主要材料：新鲜猪胰脏1个。2. 主要试剂2.5mol/L H2SO4溶液，固体(NH4)2SO4，氯化钙/粉，10％三氯/乙酸溶液，1%酪蛋白溶液，）0.1mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液，1％BaCl2溶液，5mol/L NaOH溶液。（二）主要器材组织捣碎机、手术器械、纱布、漏斗、透析袋、离心机、烧杯、pH计、离心管。【实验方法与步骤】1. 提取 取新鲜猪胰脏，放在盛有冰冷2.5mol/L H2SO4溶液的容器中，保存在冰箱中待用。去除胰脏表面的脂肪和结缔组织后，称重。用组织捣碎机粉碎。然后混悬于两倍体积的冰冷2.5mol/L H2SO4溶液中，置于冰箱中过夜。将上述混悬液以3000rpm离心10min，上层液经两层纱布过滤至烧杯中；将沉淀再混悬于等体积的冰冷 2.5mol/L H2SO4溶液中，再离心，将两次上层液合并，即为提取液。此时可留样测酶的活力。2. 分离。3. 结晶 取分离所得的胰糜蛋白酶溶于3倍体积的水中（此时可取0.5ml留样测酶活力），加(NH4)2SO4（1.44g/10ml），用5mol/L NaOH溶液调pH至6.0，在室温放置12h即可出现结晶，在显微镜下观察结晶形状。【注意事项】1. 整个操作过程在0℃～5℃条件下进行。2. 实验材料应采用新鲜胰组织。3. 分清实验过程中每次离心后各保留的是上清液，还是沉淀。4. 离子强度、pH、温度、试管的洁净度等均可影响酶的活性，如需进一步进行活性测定，务必保证固定的实验条件，严格按照程序操作。

 为啥你的细胞不愿贴壁呢？如何促进细胞贴壁？根据细胞特性分类1、 悬浮细胞（Suspension Cell）细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，如淋巴细胞。2、 贴壁细胞（Adherent Cell）在动物细胞培养过程中，必须有可以贴附的支持物表面，依靠自身分泌或培养基中的粘附因子才能在该表面生长增殖的细胞。当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞或上皮样细胞。3、 兼性贴壁细胞有些细胞并不严格地依赖支持物，它们既可以贴附于支持物表面生长，但在一定条件下，也可在培养基中呈悬浮状态生长。贴壁细胞分为：上皮细胞型，成纤维细胞型，游走细胞型和多型细胞型，在显微镜下观察时，贴壁细胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不规则的三角形或扇形或其他形态，而且晃动培养液时，细胞不动。常见的贴壁细胞有成纤维细胞、骨骼组织（骨及软骨）、心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤、神经胶质细胞、内分泌细胞、黑色素细胞以及各种肿瘤细胞等。体外培养贴壁细胞特点贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。细胞贴壁的过程使形态发生很大变化，细胞形态改变是细胞内骨架（真核细胞中的蛋白纤维网架体系，由微管、微丝及中间纤维组成的体系）本身和细胞外基质共同作用的结果。培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样，当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等。细胞附着于底物时并非一种需要能量的过程，一般认为与电荷有关。据资料记载，37℃时在2min内细胞之间即可形成键，该键可对0.01%胰蛋白酶起作用且仅发生于细胞间，细胞与底物之间则无；8min后才有稳定的键形成。贴壁细胞（除肿瘤细胞外）在体外培养条件下，完成贴壁后均为单层生长，原因是贴壁细胞有接触性抑制的特点。一般认为接触抑制是细胞间的一种识别作用，对于动物细胞的形态形成与稳定具有重要性的作用。由于贴壁细胞的一面是紧贴在培养瓶上的，如果其上方存在细胞与其相粘附，那么下方的细胞很快就会缺乏营养---饿死。接触抑制：1954年，由艾伯克龙比发现，一些细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂现象，将其命名为接触性抑制（Contact Inhibition），后来证实接触性抑制普遍存在于贴壁细胞之间。接触抑制的原理：细胞膜上有糖类和蛋白质共同构成的糖蛋白，也叫做糖被，它在细胞上起识别作用，当细胞增殖到一定程度，挨在一起时，糖蛋白就会识别这种信号，并且使细胞停止繁殖。细胞为什么要贴壁首先并不是所有的细胞在体外培养的情况下都会贴壁，但大部分来自实体组织器官的细胞都会贴壁。密度大于培养基的细胞（绝大部分细胞）通过重力作用会沉降在底面上，这是种自然属性，那么细胞要生存必定得改善这个环境，也是贴壁的主要原因-分泌细胞外基质和粘附因子（Extracellular matrix& Cell Adhesion Molecules，ECM&CAM），改善底面的结构，然后很自然就贴附在底面上了。细胞粘附分子：是众多介导细胞间或细胞与细胞外间相互接触和结合分子的统称。细胞外基质：是由动物细胞合并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。二者大多数均为糖蛋白，因此具有较强的亲水性——因此能不能贴壁不仅仅关乎细胞是否有这种能力，也与有无合适的底物（培养瓶）有关。密度小于水的细胞，如脂肪细胞，漂浮在液面上，所以不可能贴在底面上，但是如果将培养液加满，那么细胞能够与培养瓶上面的壁接触同样可以贴壁。因此可以说，细胞贴壁是适应环境的一种反应。细胞贴壁原理及相关因素大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长，在体外时这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。贴壁的过程：细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面（培养瓶，培养皿的底面）。然后，细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。贴壁过程一些特殊的促细胞附着物质（如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、Ⅲ型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子均为蛋白质，存在于培养液尤其是血清中。在培养过程中，这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，悬浮的圆形细胞再与已吸附的有促贴附物质的底物附着，以后细胞将伸展成其原来的形态。所以细胞贴壁与否和细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与培养皿壁的表面结构有关。细胞不贴壁的一些原因1. 胰酶消化时间把控不当：消化不够细胞本身就是成团的；若胰酶处理太久，容易造成细胞膜蛋白损伤，使细胞贴壁不紧，显微镜下观察立体感不强，严重的时候甚至会造成细胞死亡。2. 缺少贴壁因子：血清中含有促贴壁因子，而无血清培养基工艺中由于缺少这种促贴壁因子，细胞的贴壁效果会下降很多。3. 支原体或细菌的污染。4. 培养液配制、储存不当，如pH值过碱，Gln量太少等原因。5. 复苏的细胞本身状态不好，已经老化，失去贴附性。6. 接种细胞数目太少，无法分泌足够的细胞外基质。7. 复苏时处理速度太慢，复苏过程不当。如何促进细胞贴壁1. 适度消化细胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901几种癌细胞处理时间可适当放长，一般处理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比较容易脱落，2min足矣，P19Cl6和293细胞贴壁不紧，可在PBS漂洗后，直接换新鲜培养基打散。2. 最好用塑料瓶培养，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾胶原包被一下培养瓶，或者用盐酸对培养瓶进行蚀刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以帮助细胞贴附新的培养瓶，细胞不易贴壁，建议加多聚赖氨酸处理。3. 正确配制消化液或培养液。4. 使用合适的细胞外基质或贴壁试剂。5. 复苏新的细胞，第一周用20%血清帮助细胞复原。6. 传代接种一定要铺的均匀，避免细胞抱团生长。7. 细胞传代24小时之内，最好不要晃动，以免影响贴壁。8. 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜上，因此培养在有胶原的底物上有利于生长。人或小鼠表皮细胞培养，可以用γ射线照射后的3T3细胞为饲养层，另外降低pH、Ca2+含量和温度，均有利于上皮细胞生长。

 1、你若随便穿戴，我便生死相依你进细胞房时不换鞋，不戴口罩，不戴手套，虽然感觉呼吸畅快全身轻松，但其实是进细胞房的最大忌讳！有更严格的细胞房连帽子都要戴上。这么随便的就把我带进去见你的细胞，难怪她会被你气死，换鞋就不说了，你应该也知道有真菌吧。但你根本不能保证你口腔支原体是不是会污染细胞，每当你兴高采烈地给你的细胞哈一口气送温暖的时候，细胞就……狗带了。不戴手套，根本就清除不掉你手上的细菌真菌，要不你试试拿火燎一下你的手，焦了才算把我除干净。2、你想用紫外和酒精摆脱我，却也无法斩断我对你的情丝虽然你很想摆脱我，想用紫外和酒精消灭我，是的，确实伤到我了，但是紫外和酒精最多只能灭细菌，对真菌伤害很小，有能除细菌和真菌的Cleaner产品为什么不用呢。你不戴手套，可劲用喷壶喷手，三个字：然并卵。用Cleaner产品清洁超净台时为什么不用棉球而要用喷壶呢？因为用棉球的话，可以在灭菌的同时把菌体从手上撸下去。而喷壶只能短暂灭菌而已，所以要多用棉球，少用喷壶。3、世界那么大，我想去看看，可你却不停地召唤我回来①生物安全柜：这个家伙的玻璃窗是有警戒线的，超过这个警戒线，生物安全柜的风帘就起不到太大作用，而且会引入室内空气中的真菌，还会让你给细胞送温暖的呼吸里，自动带上支原体。②生物安全柜操作时：门前最忌讳乱堆东西，枪头盒、血清、管子，培养皿、移液器、酒精喷壶、酒精灯，堆了一大堆。有的都堵住了你门前的出风口。一来你操作起来并不是井井有条，会导致动作幅度过大，扰乱气流。二来这些东西本身也会挡住风口，扰乱气流。气流变化会直接导致外部不洁净的空气流入，也同样会导致生物安全柜的洁净作用失效。这必须要注意！4、不论你管不管我，我都在水浴锅里不离不弃水浴锅里是我的温床，你那么大胆的将你心爱的细胞放在我身边复苏，呵呵，37℃复苏完，你猜我刚刚对你的细胞都做了什么？湿漉漉的冻存管，任你再怎么喷酒精也并没有什么意义了。那要怎么办，水浴锅一来是定期清洁，二来是加一些抑菌剂，比如Bath Cleaner，用一次一周可保证水浴锅清亮。别别别，不是让你往里面加双抗！腐蚀水浴锅的硫酸铜也千万别往里面加，有一个Bath Cleaner 就够了。5、真菌走了，留下的孽种叫孢子说完水浴锅，那接下去讲讲另一个坐拥37℃温床的水环境，也就是培养箱的水盘。有几次当你不高兴搭理我的时候，我就会放肆的生长，水盘里飘着特别大的一块块霉斑就是我的杰作。即使换了水，但是我留下的孢子，是你不敢想象的。一污染就一箱子全报废了，培养箱要定期用 Incubator Cleaner 擦拭隔板和内壁，为了你心爱的细胞着想，一周一次就够了。水盘也一样，水盘中加入Tray Cleaner就可以有效抑制和杀死细菌真菌。

　　真菌毒素检测的采样　　按照正确的步骤进行采样和样品制备是保证真菌毒素检测质量的基础。这是获得准确真菌毒素检测结果的最重要也是经常被忽视的步骤。如果没有正确采集和制备样品，真菌毒素检测结果的不确定性会很高。　　第一步是从围栏里、卡车车厢、储物箱或喂养动物的食槽和水槽中获得一份具有代表意义的谷物、饲料成品或食物样品。　　采样设备　　1. 手动取样　　(1) 粮食空心取样管或实验者(驳船、箱车、卡车、料斗容器 )　　(2) 取样袋　　2. 抽气取样或液压探针(底部升降梯或加工厂探针)　　3. 机械取样系统　　-分流型 (自动对粮食流剖面采样或截断粮食流采样)　　-单点型 (粉状商品的螺旋采样)　　采样模式 (大型粮食集装箱、储存箱或粮食槽)　　平底卡车和拖车，其中粮食深度大于1.2m应使用7-探针模式并且拖车应按照独立容器处理。平底卡车或拖车装载的粮食深度不足1.2m应使用9-探针模式。　　2. 底卸式货车 (3-间隔，廊道式或门式)，在中心位置或者稍偏离中心位置与垂直方向成 10°角插入探针，避免接触横梁。　　3. 平顶驳船， 在距离驳船尾部 1.2m和距侧面 2.1m的位置进行第一次采样。然后向船 头方向每隔4.5m采一次样。最后一次采样位置需距船头 约1.2m、距侧面 约2.1米。　　4. 储藏箱的采样需要使用气动/机械的自动采样设备或合适的探针进行。如果不具有此条件，就需要根据采样模式对饲料和食物进行 5 探针采样、对谷物进行9探针采样。使用螺旋采样器和采样探针联用，从储藏箱底部收集大约 0.25 kg样品。如果怀疑 储藏箱受潮，则采用探针采样模式从容器边缘采集可能受潮的样品，并从容器中心采集受潮可能最小的样品。将边缘样品和中心样品分别装入不同的取样袋，系紧袋口。在检测前置于干燥凉爽的环境里保存。将一个样品标记为 “储藏箱边缘” 另一个标记为“储藏箱中央”。　　5. 食槽和饲料槽　　禽舍中的食槽：在样品袋中采集 12 份每份 75 克的样品，4 份是饲料的初始状态，4 份是饲料的中间状态，4 份是饲料的最终状态。系紧袋子，在检测前置于干燥凉爽的环境中保存。　　饲料槽：在提供的样品袋中采集 12 份每份 75 克的样品。在饲料槽的每个部位都采集一些样品。系紧袋子，在检测前置于干燥凉爽的环境中保存。　　6. 在装载与卸载中采样　　从储藏箱中获得具有代表性样品的唯一可行的方法是在装卸过程中采样。过程中使用自动采样设备和手工取样均可。在粮食装卸过程中采集一系列 5-100g 的样品。对于谷物样品 总量为2.5kg，对于饲料和食品样品总量为1kg。尽可能的在开始装载时进行第一次取样，在快要装载完毕时进行最后一次取样。将所有样品转移至一个样品袋中，系紧袋子，在检 测前置于干燥凉爽的环境中保存。　　合适的样品数量　　如果样品数量太少，毒素可能完全流失掉或者检测值低于真实值。足够大的(实践中)样品数量对保证真菌毒素检测结果的准确性非常重要：　　1. 玉米或生咖啡的最小样品量：大约 2.5 kg　　2. 小麦或大麦的最小样品量：大约 1.5 kg　　3. 面粉的最小样品量：大约 1.5 kg　　真菌毒素检测的取样和留样　　样品分配（取样）　　1. 必须将整个样品全部研磨，样品研磨粒度要求95%过20目筛； 2. 制备两个500 g的次级样品，一个用于检测，另一个用于样品留存； 3. 用于检测的次级样品，可以采用如下两种方式进行处理： (1) 使用合适的分样设备，将次级样品缩分至检测所用样品量； (2) 将次级样品放入干净容器中，使用搅拌棒或者钥匙用力上下搅拌30秒，以达到均质的目的，然后称取检测所用的样品量。　　样品留存　　1. 复检样品留存应按照保留样品代表性的原则进行； 2. 使用结实的纸袋或大信封保存样品，并注明样品编号和日期； 3. 样品存放地应远离热源、窗口并避免阳光直射，并保持干燥，如有条件 应放置在 2-8℃条件保存。　　留样销毁　　1. 样品留存期结束后，应在外包装上注明“实验室检测样品，不可用作食品或饲料”； 2. 将留存样品倒入垃圾箱或其他指定地点。　　留样邮寄　　邮寄样品时应选用结实的容器，确保运输时的样品安全； 2. 有条件时可采用冰袋和泡沫箱等手段保证低温运输，但要做好样品防潮措施； 3. 请在外包装上注明“实验室检测样品，不可用作食品或饲料”。

检测蛋白的实验有很多种,WB实验和ELISA实验是比较常用的两种实验方法,这两种方法哪一种的实验结果更为可靠呢?有些人说ELISA自己包被抗体的话会比较麻烦，WB相比更加科学，容易被杂志接纳。但是血清中没有内参可以选择。是不是ELISA实验操作要简单很多，那么又如何来解决这样的一个问题呢？今天远慕来为您解答这个疑惑。一、WB和ELISA的敏感性有所区别。虽然前者用ECL显色敏感度可达pg级，但不同的样品来源和抗体的质量，不能保证每次都到这个级别;而ELISA可以达到ng级。也就是说ELISA更适于丰度低的蛋白检测。而且由于ELISA检测所用的样品少，也适用于样品来源有限的蛋白浓度检测。二、在定量方面，ELISA一般用于定性，定量也可， WB可以做到半定量。三、ELISA不如WB的特异性好。四、关于血清内因子的检测，如果WB检得出就不要用ELISA。血清内参的问题，在ELISA里也一样存在。操作来说ELISA当然简单，但由于两种方法各有优点，不能全面相互代替。ELISA:优点：灵敏，能够定量（有标准品的情况下）缺点：需要购买试剂盒（自己做试剂盒的话建议您放弃），价格昂贵（双抗夹心法需要两个抗体，当然贵啊），而且需要排除假阳性假阴性的问题，需要考虑的问题较多。此外就是发文章没有图片不太好看WB：优点：试剂便宜，认同度高，发文章没有问题，如果用高灵敏度的发光试剂盒也可以达到非常高的灵敏度缺点：操作步骤较多，如果实验室没有成熟的条件，想开展起来需要花一些功夫，分子量很大（个人认为>200kD）和很小（

一、M蛋白的基础知识M蛋白是浆细胞或B淋巴细胞单克隆大量增殖时所产生的一种异常免疫球蛋白，其氨基酸组成及排列顺序十分均一，空间构象、电泳特征也完全相同，本质为免疫球蛋白或其片段（轻链、重链等）。由于它产生于单一克隆，又常出现于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、恶性淋巴瘤病人的血或尿中，故称M蛋白。这些M蛋白大多无抗体活性，所以又称为副蛋白。M蛋白血症可分为恶性与意义不明的两大类。恶性M蛋白血症多见于多发性骨髓瘤（包括轻链病）、巨球蛋白血症、重链病、7SIgM病（Solomen－Konkel病）、半分子病及不完全骨髓瘤蛋白病（C端基因缺陷）等。意义不明的M蛋白血症又分为两种，一种是与其他恶性肿瘤（如恶性淋巴瘤）伴发者，另一种即所谓良性M蛋白血症。M蛋白的检测方法主要有琼脂或琼脂糖电泳、免疫电泳、免疫固定电泳、选择免疫电泳等。 二、M蛋白的鉴定1.多发性骨髓瘤与巨球蛋白血症时的M蛋白检测和鉴定（1）血清总蛋白定量。90%的患者血清总蛋白含量升高（70%的患者＞100g／L），约10%的患者正常或甚至偏低（如轻链病时）。（2）血清蛋白醋纤膜或琼脂糖电泳。M蛋白在电泳时出现典型的单株峰（亦称M区带），特点是区带窄而浓，扫描时呈现尖高峰，在γ区高比宽≥2，在β区≥1.此M区带可因Ig的不同而出现在在γ～α2的任何区域。M蛋白增殖的另一特点是其他各区带明显减少，显示图像较简单。有时有的患者血中M蛋白并不高，这是由突变细胞的Ig分泌能力决定的。这种病人的血清在电泳时M峰可不明显，易被其他蛋白掩盖，需采用稀释血清成应用其他敏感方法如免疫固定电泳来检测。（3）血清Ig定量。一般M蛋白所属Ig含量均显著增高，其他类Ig则正常或显著减低。（4）免疫电泳。①正常人血清免疫电泳结果：可分辨出20多种蛋白成分。在阳极端有船形很浓的沉淀线为白蛋白。通常Ig组分靠阴极端，最靠近加样孔者为IgM，依次为IgA、IgG，三者成平滑的连续沉淀线。②多发骨髓瘤：多发性骨髓瘤分IgG、IgA、IgM、IgI）和IgE5种，IgG和IgA又分亚类，所有Ig的轻链又分两个型。因此，免疫电泳时变形沉淀线的位置随各分子的电泳区带不同而异，从慢γ～β2区皆可出现。IgG1多出现在慢γ区，IgG4在β～α2区。M蛋白与相应的抗重链血清、抗轻链血清形成迁移范围十分局限的浓密的沉淀弧。由于此种病人血清中Ig含量甚高，免疫扩散时可出现抗原绝对过剩而不出现沉淀线，此时需稀释血清重做，往往可获得满意结果。③巨球蛋白血症：由于IgM分子大量增殖所致。在免疫电泳时，常常出现以下特征：一是沉淀线明显变形。正常情况下，IgM形成短小沉淀线，不易看到变形。当IgM大量出现时，则会使整个IgM沉淀线变形。二是抗原孔周围和电泳纵轴出现团块状沉淀。三是电泳时IgM组分无迁移，这多是IgM分子聚合，电泳不移动所致。（5）尿本－周蛋白检测。①定性检测：用热沉淀法和磺基水杨酸法。②免疫电泳法：用待检尿浓缩后进行免疫电泳，大多数多发性骨髓瘤病人和轻链病患者，仅出现一条致密的弓形弯曲的沉淀线。本法60%～80%的骨髓瘤病人和几乎全部轻链病病人可检出尿本周蛋白。③轻链白蛋白－戊2醛交联免疫电泳法：多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症及轻链病可呈阳性，正常人阴性。本法尿本周蛋白检出率为100%，假阳性4%，尿中含有200μg／ml时即可出现阳性结果。2.重链病时M蛋白检测与鉴定与多发性骨髓瘤相同，免疫电泳时由于重链分子较Ig分子小，故迁移率快，电泳位置较靠阳极侧（β～α）。但重链病一般需选择免疫电泳证实。3.7SIgM病时M蛋白的检测与鉴定一般IgM为五聚体，沉降系数为19S，而7SIgM患者的IgM为单体，沉降系数为7S.证明7SIgM有两种方法：一种是在测定IgM总量后，将被测血清1～2ml过Sepharose6B柱，再根据洗脱峰图用面积仪测出7SIgM占总IgM的百分比，与IgM总量换算即得7SIgM的绝对值。另一方法即为植物血凝素（PHA）选择电泳。此法原理是五聚体IgM可与PHA结合形成沉淀，而单体IgM不与PHA结合。在琼脂胶中加入PHA，后进行电泳，五聚体IgM被PHA所阻留，而7SIgM继续向阳极泳动，并可与随后加至抗体槽中的IgM抗血清反应，形成单一沉淀弧。4.半分子病时M蛋白检测与鉴定所谓半分子病（half－molecule）是指此种M蛋白由一条重键和一条轻链组成，分子量是正常Ig分子的1／2或＜1／2（因半分子病肽链往往有部分缺失）。至今报告过IgG和IgA的半分子病。除上述检测方法外，尚须对“半分子”进行特殊鉴定。方法有：①免疫电泳法鉴定半分子M蛋白的迁移率。电泳时发现具有IgG或IgA的电泳特征而迁移率明显快于二者时（泳向正极可达α2区），应注意有无本病的可能。②十二烷基硫酸钠（SDS）－聚丙烯/酰胺凝胶电泳，推算M蛋白的分子量。③超速离心分析，测定M蛋白的沉淀系数。④Fc抗原决定簇的确定。用相应抗重链血清对比患者与正常人相应Ig的区别。5.测定免疫球蛋白轻链型筛选M蛋白正常人有五类免疫球蛋白，其轻链有两种型，即κ型或λ型。对于每个Ig分子而言，其轻链只有一种，不是κ就是λ。但对一个体的Ig分子而言，则有κ和λ两种链型，且其比例基本上是固定的，即κ／λ约为2∶1.任何原因引起的Ig分子多克隆增殖，如慢性肝病，系统性红斑狼疮、某些恶性肿瘤时，其κ／λ值不变。而M蛋白发生时，是单克隆细胞的恶性增殖，所以在Ig量明显增高的同时，其κ医学教育|网搜集整理／λ比值必然发生改变，即一种轻链型的Ig分子增多。利用适当的方法，分别定量测定血清中κ、λ型Ig分子的量，即可特异而简便地诊断M蛋白病。测定方法有两种，一是用浊度测定技术分别测定含κ或λ的Ig的量，一种是用单相免疫扩散法测定κ型、λ型Ig的含量及比值。单扩法是在琼脂凝胶板上打孔，排列呈梅花型，中心孔注入抗κ、抗λ混合抗体，周围孔放正常人及患者待测血清，然后进行扩散。正常血清与抗血清之间可见对称双线。若患者的κ轻链Ig升高，其沉淀线向内移，而λ线有不同程度向外移，双环间距增宽。若λ轻链Ig含量增高，则表现为环距减小、融合或跨环现象。此外，该法对IgG、IgA、IgD类型的轻链诊断准确率较高，而对IgM型诊断不够理想，其原因是IgM分子大，扩散迁移率小，同时五聚体立体结构也影响了抗轻链抗体与轻链结合。若用二疏基乙醇处理将IgM解为单体，则阳性率大大提高。6.良性M蛋白血症良性M蛋白血症主要指那些血清中存在电泳均质的免疫球蛋白或其片段，但无临床症状，长期观察也未发现骨髓瘤或世球蛋白血症的病人。老年人中发现良性M蛋白血症者较多，应注意与多发性骨髓瘤相鉴别。

菌种活化就是将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境。要明白菌种活化的情况就需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国/际国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。对于不同的保存方式活化的方式也不同：1.定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可；2.液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次；3.沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面；4.真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养；5.-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养；6.液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。总结一下菌种活化需要以下几个步骤：第一、配置菌种适宜生长的培养基。第二、将菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻的菌种解冻。第三、将通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养，此步骤称为菌种复壮。第四、挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的菌落。经过这四个步骤就到达将菌种从保藏状态活化的目的。

提质粒是分子生物学中基本，easy的实验。完全不需要借助大脑，直接照着提取试剂盒中的操作说明傻瓜操作即可（其实应该由机器人在实验室中操作这些简单却耗时的实验）。尽管操作简单，提质粒却也是一个比较重要的步骤，提出质粒的质量和数量将直接决定着后续实验室的成败。当我们按照试剂盒中操作说明进行操作时，我们会看到P1，P2，N3, PE，EB等不同的溶液（不同试剂盒可能标识不同）。那么大家是否知道每瓶溶液中装的什么？它们在质粒提取过程中的作用又是怎样的？质粒提取采用的是强碱裂解法（alkaline lysis），那么我们现在来看一下溶液 P1 ， P2， N3, PE, EB都是什么。溶液1（P1）组分浓度 25 mM Tris-HCl（pH8.0），10 mM EDTA，50 mM 葡糖糖（Glucose）溶液1的主要作用是将菌体沉淀悬浮起来。25mM Tris-HCl是缓冲溶液，保证反应体系的pH恒定。EDTA是金属离子螯合剂，10 mM EDTA的作用是与微生物体内的金属离子相互结合，抑制DNase的活性。50 mM葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，保证菌体悬浮，延缓菌体沉降的时间。溶液1在使用前通常要加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。由于RNA酶属于蛋白质，蛋白质稳定性很差，所以加了RNase A的溶液1需要低温4oC保存。溶液2（P2）组份浓度 250 mM NaOH，1％（W/V）SDS（十二烷基硫酸钠）溶液2的主要作用是细胞裂解。溶液1将细胞悬浮后，就需要添加溶液2了，溶液2的作用就是对细胞进行裂解。溶液2只包括两种成分：氢氧化钠和SDS。真正起到到细胞裂解作用的是氢氧化钠，这也是为什么这个方法会被叫做碱裂解法。氢氧化钠会破坏细胞膜的结构，使之发生bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化，从而导致细胞的裂解。SDS的作用将在下一步提到。添加溶液2后需要注意的一个是时间一定不能过长，另一个是不可以剧烈震动离心管。时间过长以及剧烈震动都将导致氢氧化钠破坏基因组DNA，断裂的基因组DNA碎片将会与相似大小质粒一同被抽提，污染样品。溶液3（N3）组份浓度 3M 醋酸钾（potassium acetate），5M 醋酸溶液3的主要作用是中和第二步加入的强碱以及清除掉蛋白质等细胞内的杂质。N是neutralized的缩写。强碱溶液氢氧化钠长时间与DNA基础会破坏其结构，因此需要进行中和。中和氢氧化钠，5 M醋酸就足够了，为何又要加入醋酸钾呢？做过质粒提取实验的同学应该记得，在加入溶液N3后，会有大量沉淀出现。这些沉淀其实醋酸钾与溶液2中的SDS相互作用，反应生成的十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS）。加入溶液N3后，SDS遇到钾离子，生成PDS不溶于水，会迅速发生沉淀。那么溶液3的加入是如何清除掉蛋白质，基因组DNA等杂质的呢？道理是，溶液2中加入的十二烷基硫酸钠(SDS)很容易与蛋白质结合，平均两个氨基酸就会结合一个SDS分子，二者结合会形成SDS2多肽复合体，这样变性蛋白质将溶解在溶液中，从而使得多肽链更好地与基因组DNA缠绕。加入溶液3后，由于十二烷基硫酸盐与变性蛋白质结合成复合体，十二烷基硫酸钾的沉淀就将变性的蛋白质一起沉淀，同时变性的蛋白质与基因组DNA缠绕，结果也大部分被共沉淀了。而高离子浓度的溶液又加速了这一沉淀过程。此外，溶液被中和后变性蛋白质表面电荷减少,也可以促进变性蛋白质沉淀。溶液PE （wash buffer）组分浓度10 mM Tris-HCl （pH 7.5）， 80 % 乙醇（Ethanol）Wash buffer的作用主要是清洗掉多余的盐离子。试剂盒中都是利用硅胶柱进行DNA提取的。在DNA与硅胶柱吸附后，需要利用Wash buffer清洗掉多余的盐离子。Wash buffer中含有高浓度的乙醇，由于乙醇会影响后续的酶切或测序反应，在洗脱DNA前必须要在离心机内”空甩”柱子，完全清除掉乙醇。溶液EB（Elution buffer）组分浓度10 mM Tris-HCl （pH 7.5）EB的作用就是洗脱硅胶柱上的DNA样品。Elution buffer中不能含有过高浓度的盐离子，因为在高盐环境中，盐阳离子会打破硅胶负氧根和水之间的氢键，使得整体的硅胶携带正电，会吸引携带负电的DNA分子。另外，加热过的洗脱液（不同公司的质粒提取试剂盒中溶液成分可能有所差异，比如P1中可以去除掉葡萄糖，溶液PE甚至可以直接用水来代替等等。质粒提取实验是分子生物学中的基本且重要的实验，尽管实验本身简单，但其原理还是有些复杂的。小编相信，知其然亦要知其所以然，清楚实验的原理，当实验出现问题之时，会能够更容易找到原因并给予纠正。

  养细胞真的是磨练人性格的一项工作。细菌真菌支原体各种污染都经历过了，能把癌症细胞养到绝种也是很无奈。生活的阅历就是最大的智慧，所以今天跟大家汇总了细胞间常用的无菌技术操作指南如下:1、我们要挑选了一个平时很少有人用的实验室作为无菌室，超净台不能放在靠近门口和窗户的位置，这个区域要保持干净无灰尘。为保证超净台工作面的无菌，使用前需用75%的乙醇擦拭工作面。2、每天实验开始时候，超净台/实验间 照20分钟紫外是不错的选择。拿培养瓶和培养液时候请托下面拿，切忌不要拿瓶颈部位。3、工作前和工作后，都要对超净台进行擦拭，特别是有液体溢出的地方。各种盛装液体的瓶子从冰箱内拿出来后，都要用75%乙醇进行擦拭。为确保无菌操作，最好每次使用之前也要再进行擦拭。4、在操作过程中，超净台上的所有物品需摆放整齐。整齐的原则是：需要的东西要很容易拿到，拿东西的时候不能跨越其他物体；超净台内的物品不宜过多，否则会影响无菌空气的层流；实验完毕后擦拭整个超净台面，并移走所有物品。5、对于我们从试剂公司购买的培养基、血清或者其他试剂，一定是经过厂家的质量监控保证无菌的，但是盛装试剂的瓶子外表不是无菌的。所以在实际操作中，要在超净台下拆下外包装，每次使用前需用75%乙醇擦拭。（在这里提出一点疑问，有很多人说培养基和血清不能照紫外，也有人说二者是可以照紫外的，希望有大神帮忙回答一下）6、从其他实验室借来的细胞，因为无法保证原来的实验室或运输途中是否有污染情况出现，所以首先要在没有抗生素的情况下，和本实验室的细胞分开培养一段时间，直到证明它们没有被污染再放到同一空间。7、如果不是大批量培养细胞，我们会用广口瓶配制盛装培养基。广口瓶特有的深螺旋盖子防污染的效果很好，但是清洗的时候要特别注意，以防瓶盖内残留的液体没有清洗干净。8、培养皿的敞口时间不易过长，不要在敞口的培养皿及培养皿的上方操作。当把培养皿从培养箱拿出或放入培养箱中时，小心不使它们倾斜或受到摇晃，避免培养基进入盖子和皿身的夹缝中。如果不小心出现上述情况，应用75 % 乙醇擦掉溢出的培养基，并更换新的盖子。9、虽然我们在操作的过程中会带无菌手套，穿无菌服，但是个人卫生也是很重要的一点。手部的清洁可以湿润皮肤，洗掉一些微生物，带走某些皮肤干屑。如果女生是长头发，也要盘头或马尾系在身后。如果患有感冒，最好在感冒好之前不要进行细胞培养工作，即使带上口罩，也不能阻挡感冒病毒。10、玻璃吸管或塑料吸管是转移液体最/方便的途径。灭菌前，要在玻璃吸管的吸口端加一个棉塞，这个塞子能起到防止液体回流造成交叉污染的作用。11、污染可以从一个小范围或一个培养皿扩散到几个培养皿，乃至整个培养箱中。观察培养皿中细胞状态的时候，一定要肉眼和显微镜双重仔细观察；不能与其他实验人员公用同一个瓶子，不同种类的细胞系哪怕培养基相同，也不能使用同一个瓶子。12、在操作过程中，打开和关上瓶盖的前后都需要在酒精灯火焰旁灼烧瓶口和瓶盖。由于空气对流的原因，在火焰旁操作，火焰旁的空气向上走，可以减少附近区域灰尘下降。13、超净台之所以会营造出一个无菌的环境，是因为里面有持续稳定的过滤气流通过超净台面。水平式超净台的气流是从实验人员的对面吹出，与台面平行。垂直式超净台的气流是从顶部向下吹的台面，被吸入后循环利用。所以对于垂直式超净台的实验人员来说，操作时不要在开口的上方操作；而对于水平式的超净台，实验人员尽量不要在开口的后方操作。14、水平式超净台可以提供相对稳定的气流，对培养物和试剂的无菌保护作用较强。但是垂直式给予实验人员的保护更多。15、在操作过程中，不要把液体从一个瓶子倒入另一个瓶子中，因为这种倾倒方式会将让液体变成连接瓶内外空气的桥梁。即使瓶子是无菌容器，这种方式也会增加污染的风险。16、水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换 (灭菌水加进去)。17、操作时要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。18、离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用前用后都照个 30 分钟。19、不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手赶紧做两件事：检测是否有支原体污染； 迅速扩增冻存。20、发现有污染迅速处理掉，特别是当你养了很多种细胞时； 细菌污染，真菌污染很容易发现，支原体污染的话，细胞会长的慢，买个支原体检测的 kit 定期检测一下。21、细胞只要是被细菌污染了，不管用PBS冲洗多少遍，无论是否用高浓度抗生素处理多久，只要抗生素一撤，污染的细菌必会暴发，唯1能做的就是扔掉这盘细胞。22、非常珍贵的肿瘤细胞被细菌污染了并且没有冻存备份怎么办？可以尝试小鼠皮下接种，待皮下接种成功后，取下肿瘤消化继续培养，小鼠体内的免疫系统会清理掉细胞中污染的细菌。23、如果细胞反复污染，记住一定不是操作问题，一定是有污染源，请仔细寻找污染源：培养基、血清、胰酶、培养瓶…，可以提取上述试剂在新的培养基中进行培养，观察哪一组能培养出细菌。最/简单粗暴但又快捷的方法就是将所有的细胞培养的试剂和器皿换成新的。细胞污染是非常头疼的一件事情，祝大家细胞培养顺利！

细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。各国细胞库支原体污染的统计表，如下：国家 受支原体污染(%) 报告年度USA－FDA 15 1993(past 30 years)USA－ATCC 15-20 1992Japan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 1981 1987-19931998Germany－DSM 36 1990-1994Argentina 65 1987Israel 32 1986-1993China 95 1990造成支原体高污染率的原因为：1.支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式4.细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染5.研究或操作人员忽略污染问题而支原体污染了来源:1.已受污染的细胞2.操作人员的疏失3.已受污染的培养基、血清4.操作环境不良、实验器具不洁等由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。去除支原体污染：1. 抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）2. Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine3. Anti-sera预防与控制方面可从以下各点加强注意：G 设备方面：1.使用已作支原体测试ok之细胞株2.于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞3.使用不添加抗生素的培养基培养细胞G 检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。G 实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求有关支原体污染之问题与回答：o 应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。o 如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？直接灭菌后丢弃之。

在中学化学教学中，在讲到油脂、蛋白质以及胶体时，经常要解释油脂皂化反应后高级脂肪酸钠与甘油的分离，为何要加细小食盐颗粒？食盐是如何使高级脂肪酸钠从溶液中析出的？在蛋白质溶液中为何加少量的硫酸铵能促进蛋白质的溶解，而加高浓度的硫酸铵却会使蛋白质析出呢？而硫酸铜溶液同样是盐溶液却使析出的蛋白质不像前者那样可溶于水呢？为此我们必须明确盐溶、盐析和变性的概念.一、盐溶在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大，这种现象称为盐溶.二、盐析向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，其中以硫酸铵最为常用，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质的溶解度降低而从溶液中析出的现象称为盐析.当高浓度的中性盐加入到蛋白质溶液中，对蛋白质主要产生两种影响：1.破坏了水化层：在高浓度的中性盐溶液中，由于蛋白质和盐离子对溶液中水分子都有吸引力，产生与水化合现象，但它们之间有竞争作用，当大量中性盐加入时，使得盐解离产生的离子争夺了溶液中大部分自由水，从而破坏蛋白质的水化作用，引起蛋白质溶解度降低，故从溶液中沉淀出来.2.破坏了电荷：由于盐是强电解质，解离作用强，盐的解离可抑制蛋白质弱电解质的解离，使蛋白质带电荷减少，更容易聚集析出.盐析沉淀的蛋白质保持它的天然构象，能再溶解，生物活性不受影响，所以是物理变化，其过程是可逆的，盐析是蛋白质分离纯化过程中最常用的方法之一。油脂皂化反应后高级脂肪钠与甘油的分离，需加细小食盐颗粒，使高级脂肪钠的溶解度降低而从溶液中析出。三、变性指蛋白质在外界理化因素的影响下，如热、紫外线、X射线、强酸、强碱、重金属（如铅、铜、汞等）盐、一些有机物（甲醛、酒精、苯甲酸）等的作用下，蛋白质的次级键被打断，而肽键未断，蛋白质的空间结构遭到破坏，而一级结构未改变导致蛋白质的理化性质和生物学功能改变，叫蛋白质的变性.蛋白质变性后往往会沉淀，沉淀后不能在水中重新溶解，是一种不可逆的过程，是化学变化过程，但要注意沉淀的蛋白质不一定变性，如蛋白质的盐析，蛋白质的变性常用于杀菌、消毒等.

无菌检查和微生物限度检查的区别1、检验方法不同（1）无菌检查是指对药典规定的药品、敷料、缝线、无菌器具等品种进行无菌检查的方法。（2）微生物限度检查是检查非处方杀菌剂及其原料、辅料的微生物污染程度的一种方法。2、检验要求环境不同（1）无菌检查是在洁净的A级单向流通空气区或隔离系统中进行的。整个过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。必须验证单向气流区域和工作台的清洁度。生物制品的无菌检验按照《中国生物制品规程》中有关无菌检验的规定执行。（2）微生物限度检查：微生物限度检查应在环境洁净度10000级以下的局部洁净度100级的单向气流区进行。整个检验过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。3、判断结果方法不同（1）用需气菌、厌气菌培养基4管及真菌培养基2管，分别接种金黄色/葡萄球菌、产孢梭菌和白色念珠菌。将一管添加到规定数量的试验产品中，并将所有培养基管放置在规定温度下3-5天。如果微生物在每种培养基24小时内生长良好，则试样没有抑菌作用。（2）微生物限度检查：被检培养基平均菌落数与对照培养基平均菌落数之比大于70%，菌落大小应与对照培养基相同。确定该介质的适用性符合规定。微生物限度检查仪主要特征:1.一体化超小型设计，减小了对层流台操作空间的占用。2. 滤膜预先灭菌,即拆即用,可将主要污染物源降到低,提高检测可靠性3.过滤杯采用独特的唇形密封设计,不使用夹钳和 O 型圈,确保无泄 漏操作和均匀的微生物回收率4.可同时抽滤多张滤膜，大大提高了工作效率。5.滤杯采用可重复使用材料设计，经久耐用，节省成本，操作方便。6.每个滤头采用独立控制的方式，方便操作人员灵活使用。7.无油真空泵设计，噪音低。8.仪器表面经镜面处理，便于清洁和消毒。9.过滤头可以火焰快速灭菌,方便连续实验操作；10.已氧化的美观的把手分布基座两端，使其更加稳固；11.稳固的低重心设计使其不会因溶液满载而发生翻倒。

 一、pH值对发酵的影响　　发酵培养基的pH值，对微生物生长具有非常明显的影响，也是影响发酵过程中各种酶活的重要因素。pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面：①影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；②影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄；③影响培养基中某些组分的解离，进而微生物对这些成分的吸收；④pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。　　培养基中营养物质的代谢，是引起pH值变化的主要原因，发酵液pH值的变化乃是菌体代谢的综合效果。由于pH值不当，可能严重影响菌体的生长和产物的合成，因此对微生物发酵来说有各自的最适生长pH值和最适生产pH值。各种不同的微生物，对pH值的要求不同。多数微生物生长都有最适pH值范围及其变化的上下限：上限都在8.5左右，超过此上限，微生物将无法忍受而自溶；下限以酵母为最低(2.5)。但菌体内的pH值一般认为是中性附近。pH值对产物的合成有明显的影响，因为菌体生长和产物合成都是酶反应的结果，仅仅是酶的种类不同而已，因此代谢产物的合成也有自己最适的pH值范围，如合成青霉素的最适pH值范围为6.5～6.8。这两种pH值的范围对发酵控制来说都是很重要的参数。另外，pH值还会影响某些霉菌的形态。　　一般认为，细胞内的H＋或OH－能影响酶蛋白的解离度和电荷情况，改变酶的结构和功能，引起酶活性的改变。但培养基的H＋或OH－并不是直接作用在胞内酶蛋白上，而是首先作用在胞外的弱酸(或弱碱)上，使之成为易于透过细胞膜的分子状态的弱酸(或弱碱)，它们进入细胞后，再行解离，产生H＋或OH－，改变胞内原先存在的中性状态，进而影响酶的结构和活性。所以培养基中H＋或OH－是通过间接作用来产生影响的。pH值还影响菌体对基质的利用速率和细胞的结构，影响菌体的生长和产物的合成。Collnig等人发现产黄曲霉的细胞壁的厚度就随pH值的增加而减小：其菌丝直径在pH6.0时为2～3μm；pH7.4时为2～18μm，并呈膨胀酵母状；pH值下降后菌丝形态又会恢复正常。pH值还影响菌体细胞膜的电荷状况，引起膜透性发生改变，因而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的形成等。　　如同温度对发酵影响一样，pH值对产物稳定性也有影响。如在β-内酰胺抗生素沙纳霉素(thienamycin)的发酵中，考察pH值对产物生物合成的影响时，发现pH6.7～7.5之间，抗生素的产量相近，高于或低于这个范围，合成就受到抑制。在这个pH值范围内，沙纳霉素的稳定性未受到严重影响，半衰期也无大的变化；但pH>7.5时，稳定性下降，半衰期缩短，发酵单位也下降。青霉素在碱性条件下发酵单位低，也与青霉素的稳定性有关。　　由于pH值的高低对菌体生长和产物的合成产生明显的影响，所以在工业发酵中，维持最适pH值已成为生产成败的关键因素之一。　　二、发酵过程pH值的变化　　在发酵过程中，pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。在产生菌的代谢过程中，菌体本身具有一定的调整周围环境pH值，构建最适pH值的能力。曾以产生利福霉素SV的地中海诺卡菌进行发酵研究，采用pH值为6.0、6.8、7.5三个出发值，结果发现pH值在6.8、7.5时，最终发酵pH值都达到7.5左右，菌丝生长和发酵单位都达到正常水平；但pH值为6.0时，发酵中期pH值只达4.5，菌浓仅为20％，发酵单位为零。这说明菌体仅有一定的自调能力。　　培养基中的营养物质的代谢，也是引起pH值变化的重要原因，发酵所用的碳源种类不同，pH值变化也不一样。如灰黄霉素发酵的pH值变化，就与所用碳源种类有密切关系，如以乳糖为碳源，乳糖被缓慢利用，丙酮酸堆积很少，pH值维持在6～7之间；如以葡萄糖为碳源，丙酮酸迅速积累，使pH值下降到3.6，发酵单位很低。　　发酵液的pH值变化是菌体代谢反应的综合结果。从代谢曲线的pH值变化就可以推测发酵罐中的各种生化反应的进展和pH值变化异常的可能原因。在发酵过程中，要选择好发酵培养基的成分及其配比，并控制好发酵工艺条件，才能保证pH值不会产生明显的波动，维持在最佳的范围内，得到良好的结果。实践证明，维持稳定的pH值，对产物的形成有利。　　三、发酵pH值的确定和控制　　⒈发酵pH值的确定　　微生物发酵的最适pH值范围一般是在5～8之间，如谷氨酸发酵的最适pH值为7.5～8.0。但发酵的pH值又随菌种和产品不同而不同。由于发酵是多酶复合反应系统，各酶的最适pH值也不相同，因此，同一菌种，生长最适pH值可能与产物合成的最适pH值是不一样的。例如，黑曲霉pH2～3时合成柠檬酸，在pH值接近中性时积累草酸。谷氨酸生产菌在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下形成谷氨酰胺。谷氨酸发酵在不同阶段对pH值的要求不同，发酵前期控制pH7.5左右，发酵中期pH7.2左右，发酵后期pH7.0，在将近放罐时，为了后工序提取谷氨酸，pH6.5～6.8为好。如初级代谢产物丙酮丁醇的梭状芽孢杆菌发酵，pH值在中性时，菌种生长良好，但产物产量很低，实际发酵最适pH值为5～6。次级代谢产物抗生素的发酵更是如此，链霉素产生菌生长的最适pH值为6.2～7.0，而合成链霉素的最适pH值为6.8～7.3。因此，应该按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH值范围，使产物的产量达到最大。　　最适pH值是根据实验结果来确定的。将发酵培养基调节成不同的出发pH值进行发酵，在发酵过程中，定时测定和调节pH值以维持出发pH值，或者利用缓冲液配制培养基来维持之。定时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的pH值为菌体生长的最适pH值。以同样的方法，可测得产物合成的最适pH值。但同一产物的最适pH值，还与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。如合成青霉素的最适pH值，先后报告有7.2～7.5、7.0左右和6.5～6.6等不同数值，产生这样的差异，可能是所用的菌株、培养基组成和发酵工艺不同引起的。在确定发酵最适pH值时，要不定期考虑培养温度的影响，若温度提高或降低，最适pH值也可能发生变动。　　⒉pH值的控制　　在各种类型的发酵过程中，实验所得的最适pH值、菌体的比生长速率(μ)和产物比生成速率(Qp)等3个参数的相互关系有四种情况(见图7-3)：①第一种情况是μ和Qp的最适pH值都在一个相似的较宽的适宜范围内(a)，这种发酵过程易于控制；②第二种情况是Qp(或μ)的最适pH值范围很窄，而μ(或Qp)的范围较宽(b)；③第三种情况是μ和Qp对pH值都很敏感，它们的最适pH值又是相同的(c)，第二、第三种情况的发酵pH值应严格控制；④第四种情况更复杂，μ和Qp有各自的最适pH值(d)，应分别严格控制各自的最适pH值，才能优化发酵过程。　　在了解发酵过程中最适pH值的要求之后，就要采用各种方法来控制。首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的pH值变化在合适的范围内。因为培养基中含有代谢产酸[如葡萄糖产生酮酸、(NH4)2SO4]和产碱(如NaNO3、尿素)的物质以及缓冲剂(如CaCO3)等成分，它们在发酵过程中要影响pH值的变化，特别是CaCO3能与酮酸等反应，而起到缓冲作用，所以它的用量比较重要。在分批发酵中，常采用这种方法来控制pH值的变化。　　利用上述方法调节pH值的能力是有限的，如果达不到要求，可以用在发酵过程中直接补加酸或碱和补料的方式来控制，特别是补料的方法，效果比较明显。过去是直接加入酸(如H2SO4)或碱(NaOH)来控制，但现在常用的是以生理酸性物质[(NH4)2SO4]和碱性物质(如氨水、尿素)来控制。它们不仅可以调节pH值，还可以补充氮源。当发酵的pH值和氨氮含量都低时，补加氨水，就可达到调节pH值和补充氨氮的目的；反之，pH值较高，氨氮含量又低时，就补加(NH4)2SO4。在加多了消泡剂(如豆油)的个别情况下，还可采用提高空气流量来加速脂肪酸的代谢，以调节pH值。通氨一般是使压缩氨气或工业用氨水(浓度20％左右)，采用少量间歇添加或连续自动流加，可避免一次加入过多造成局部偏碱。氨极易和铜反应产生毒性物质，对发酵产生影响，故需避免使用铜制的通氨设备。　　目前，已比较成功地采用补料的方法来调节pH值，如氨基酸发酵采用流加尿素[(NH2)2CO]的方法，特别是次级代谢产物抗生素发酵，更常用此法。这种方法，既可以达到稳定pH值的目的，又可以不断补充营养物质，特别是能产生阻遏作用的物质。少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。也就是说，采用补料的方法，可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH值和培养液的特性(如菌浓等)等几个目的。最成功的例子就是青霉素的补料工艺，利用控制葡萄糖的补加速率来控制pH值的变化范围(现已实现自动化)，其青霉素产量比用恒定的加糖速率和加酸或碱来控制pH值的产量高25％。

　　生化试剂（Biochemical reagent）是指有关生命科学研究的生物材料或有机化合物，以及临床诊断、医学研究用的试剂。　　主要有电泳试剂、色谱试剂、离心分离试剂、免疫试剂、标记试剂、组织化学试剂、透变剂和致癌物质、杀虫剂、培养基、缓冲剂、电镜试剂、蛋白质和核酸沉淀剂、缩合剂、超滤膜、临床诊断试剂、染色剂、抗氧化剂、防霉剂、去垢剂和表面活性剂、生化标准品试剂、生化质控品试剂、分离材料等等。　　（1）免疫试剂：包括抗体及抗血清、正常血清及补体、抗原、免疫组织化学研究用试剂、细胞培养用试剂、细胞分离试剂、凝胶内扩散法及电泳试剂等。　　（2）基因工程用试剂：包括基因表达与基因重组、人工合成蛋白、激素、核酸合成试剂、核酸制剂、内切酶等。　　（3）诱变剂和致癌物质：主要供测定工作场所与生活环境中的毒物质的致癌性与化学毒物的致突变性。　　（4）临床诊断试剂：主要供医疗系统中的临床病理诊断、生化诊断、液晶诊断、同位素诊断与一般化学诊断等诊断检查中所用的一大类化学试剂。　　（5）工业用化学品包括试制开发的工业用化学品，有四千种以上，还在不断增加。

　　生物蛋白，也称生物活性蛋白，活性蛋白肽，是蛋白质中25个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。　　1、如何保持活性　　生物活性蛋白对环境的要求很高，高浓度的生物活性蛋白在常温下保存很容易失去活性，为了确保这些珍稀成分的特殊活性与功能，只能采取生物冻干工艺，在无菌环境下采用-80度的极速超低温真空冻干技术，使生物活性蛋白进入休眠状态，达到完整的保存其生物活性的目的。　　要使蛋白质具有活性，多肽链要进行修饰、加工等，还要进行折叠具有一定的空间结构,刚合成的多肽链是没有生物活性的。　　蛋白质的结构可以分为四个等级:　　一级结构：构成蛋白质的单元氨基酸通过肽键连接形成的线性序列，为多肽链。　　二级结构：一级结构中部分肽链的弯曲或折叠产生二级结构。　　三级结构：在二级结构基础上进一步折叠成紧密的三维形式。三维形状一般都可以大致说是球状的或是纤维状的。　　四级结构：由蛋白质亚基结构形成的多于一条多肽链的蛋白质分子的空间排列。　　形成肽链只是完成了蛋白质的一级结构。　　须经高尔基体和内质网加工后，达到三级结构才有功能。　　2、作用　　一方面从源头直接参与皮肤细胞的基因表达与生理信号的传递，修复细胞，阻断老化，另一方面营养肌肤，提高肌肤自身的调节能力，立体构建和维护皮肤的生态环境，实现逆龄护肤。