走出“高浓度”样本粒度检测的误区

摘要：目的：探讨高浓度样本的粒度检测是否真正可行，探讨高浓度样本检测所需要关注的重点，以及如何避免误区。 方法：查阅国内外相关文献及进行实验验证。 结论：浓度过高会导致检测结果产生偏差，真正的高浓度检测应当建立在科学的统计学意义基础之上，并且尽量避开重合限。

关键词：高浓度、粒径检测、粒度检测、动态光散射（DLS）、单颗粒光学传感技术（SPOS）。

        粒度检测是一门严谨的科学，粒度检测应当建立在科学的统计学意义基础之上，并且尽量避开重合限。现行的粒度检测手段主要是激光粒度仪，激光粒度仪主要分为三类：1、激光衍射粒度仪（Laser diffraction,简称LD），利用光衍射的物理现象，使用米氏散射理论和夫琅禾费理论，通过数学模型计算得到粒度分布；2、动态光散射激光粒度仪（Dynamic light scattering,简称DLS），利用光散射的物理现象，使用斯托克斯爱因斯坦方程式（Stokes-Einstein 方程）计算得到粒度分布；3、单颗粒光学传感计数粒度仪（Single particle optical sizing,简称SPOS），利用光阻（light extinction，或称光消减）效应，得到粒子的数量和分布。

        本文试图对高浓度样本的检测误区进行分析，并试图找到解决方案。

1、粒度检测的两个关键点

        粒度检测最主要关注的两个关键点为统计学意义和重合限。这两个关键点影响着检测结果是否可靠以及是否准确。因为粒度检测是一门严谨的科学，其呈现形式为累积分布数据。这就决定了只有足够量的大数据才能反映样本的整个体系，这就是统计学意义。利用光散射现象来检测粒度的激光粒度仪，都会碰到粒子重合造成的干扰问题，尽量避开粒子的重合现象，才是得到准确结果的正确思路。

1.1.统计学意义

        统计学意义是在数据样品较少的情况下，无法反映此样品是好还是坏，只有当数据量较多，能够反映样品的基本情况，从而判定数据是否可靠的一种方式。简单的说，在测量过程中，获得的数据越多，越能证明这个测试结果越具有可靠性和有效性。美国药典对乳剂注射液的粒度分布做了明确规定，其中大乳粒的检测标准是0.05%，根据我们的经验，每次检测中一个样品至少需要统计到25万个粒子才能使结果可信，换句话说才具有统计学意义。下图1和图2来自ISO13322-1, 粒径分析，图像分析方法。

图1

图2

        可以看到，如果得到一个相对误差5%的数据，在几何标准偏差（GSD)1.60下，所需要检测到的粒子数是60811个；如果相对误差是10%，在几何标准偏差（GSD)1.60下，所需要检测到的粒子数是15203个。这说明如果使结果可信，必须得到足够的数据量。

1.2.重合限

        重合限：顾名思义为颗粒的重合极限值，在此范围之内粒子几乎没有重合现象。样本中有很多颗粒，激光若照射到颗粒上会产生散射现象和光阻效应，当然哪种效应做主导是更具实际测试环境所决定的，比如颗粒大小。试想当两个颗粒紧靠在一起，他们产生的信号将无法区分，在仪器看来，这就是一个粒子。另外光散射会在不同的粒子之间传递，造成多重散射现象（Multiple light scattering，简称MLS，如图3所示）。在实际测试中要尽量避开上述干扰因素。

图3

        换言之，若测试浓度超过该检测仪器的重合限，测试结果将会产生偏差。在中国药典中，针对于单颗粒光学传感技术（SPOS），不溶性微粒检测要求的重合限是10000#/ml。

        图4解释了何为重合限，在测试浓度在10000#/mL之前，检测的结果与实际的样品浓度结果十分接近，甚至可以说检测的结果就可以代表真实结果，当超过重合限（10000#/mL）之后，检测结果并不会因为样品浓度的增长而增长，而是有一个下降的趋势，原因在于仪器将两个或多个粒子当成了一个粒子，从而造成数量减少。

图4

下表1是针对于动态光散射（DLS）所做的八组试验，该试验样品为DUKE—92nm标准粒子，测试仪器为PSS-Nicomp Z3000。我们改变其配置浓度，来监控其测试结果的变化。

表1——标准粒子不同浓度下测试结果比较

        从表1可以看出，当稀释150倍时，所测得的平均粒径最接近标称值。当增加或减少稀释倍数时，检测结果明显变大，远离标称值。从而可以认为该样品稀释150倍的浓度下多重光散射效应低。

图5

图6

图7

图8

        图5-8为相同样品不同浓度的检测结果，假设颗粒之间没有重合现象，如果加倍稀释的话，稀释后的样本粒子数量应该为稀释前的50%。图5为原样检测，它的浓度很高，超过了重合限。图6为稀释两倍后的检测结果，但是它的粒子数并没有根据稀释倍数的增大两倍而下降一半。图7为稀释四倍后的检测结果，这时检测到的粒子数在63000颗左右，而当稀释到八倍时，这时检测到的粒子数为33000颗左右，很明显是稀释四倍时检测到的粒子数的一半左右，此时的浓度在重合限之内。

2、结果与讨论

        浓度过高会导致检测结果产生偏差，真正的高浓度检测应当建立在科学的统计学意义基础之上，并且尽量避开重合限。但是在实际的工作、研究和学习中，不可能每个样本浓度正合适。这就要求我们自行去寻找合适的浓度，以此来保证我们的测试结果准确、真实、可信。在ISO-22412动态光散射中，也提及需要考察浓度。在乳剂检测标准中，无论是美国USP729还是中国的药典都对浓度做了特别规定。

        上海奥法美嘉科技有限公司作为美国PSS粒度仪公司在中国的代表，一直致力于传授粒度真知，在对高浓度样品的检测中，提倡进行科学有效的方法学开发及研究。而PSS粒度仪也开发上市了自动稀释模块和高性能的新一代传感器，来应对高浓度样本的检测。我们深信只有遵循严谨科学的态度以及求真求实的原则，方能促进技术的进步以及产品品质的提升。