浅谈尺寸排阻色谱法方法开发影响因素

尺寸排阻色谱法（SEC）是根据溶液中分子的大小分离化合物的，在柱子的填料中较大的分子会被较细的小孔排除在外。当以有机溶剂作为流动相，使用合成聚合物填料时，SEC就涉及凝胶渗透色谱（GPC）。在以水缓冲液为流动相和使用亲水性柱填料分离生物聚合物(例如蛋白质)时，SEC就称为凝胶过滤色谱。凝胶过滤色谱可作为用以分离生物活性物质（通常等同于在多个纯化步骤中其他的色谱技术）的前处理工具，或者亦可作为获取溶质分子信息的工具，包括分子大小或形状、聚集状态、生物聚合物与其配体结合的动力学参数。

过去凝胶过滤色谱一般采用葡聚糖、琼脂糖或者聚丙烯酰胺等软凝胶作为填料。对于可压缩的填料，必须根据流动相的流速选用适合的重力或者低压泵。软凝胶可以通过交联作用提高稳定性，这样就可以承受更高的流速和几兆帕的压强。凝胶过滤色谱分析时常用的刚性载体是：以亲水性固定相修饰的硅胶基质或者交联的有机聚合物。这些物质能在HPLC系统中使用，其机械强度可以承受几十兆帕或更高的压强。

尺寸排阻色谱法（SEC），顾名思义，它的基本原理就是当目标分析物进入凝胶渗透色谱柱，大体积的分子由于比凝胶颗粒的孔隙大不能进入孔隙，只能在凝胶颗粒之间的空隙流过，最先被淋洗出来；中等体积的分子部分可以进入凝胶颗粒的孔隙，并经颗粒间的空隙流过，淋洗出来的顺序在大体积分子和小分子之间；体积较小的分子比凝胶颗粒的孔隙小，可以进入凝胶颗粒的空隙，并在凝胶颗粒的孔隙以及颗粒之间的空隙不断进入出来扩散，速度最慢，所以是最后被淋洗出来的。当确定仪器型号和实验所需条件后，化合物的淋出体积就与其分子量有关，分子量越大，其淋洗体积越小，具体分离原理如图。

Xtimate^® SEC色谱柱是月旭推出的硅胶基质的体积排阻系列色谱柱，其色谱填料为高纯度、具有良好稳定性的硅胶微球表面键合亲水性聚合物。月旭科技采用特殊的表面修饰技术，确保了该填料具有良好的稳定性和批次重现性。

尺寸排阻色谱是根据溶液中分子量大小分离的，其保留时间取决于溶质分子进出固定相孔结构的相对渗透度。然而这个是在理想状态下的分离情况，色谱柱内还存在其他次级作用力，对目标物的分离产生影响。

因此，以Xtimate^® SEC色谱柱做方法开发时，需要注意以下几点因素：

可根据目标物的分子量，来选择合适孔径的色谱柱。

为避免色谱柱堵塞，所有样品和溶剂，包括缓冲盐，都必须在使用前用0.45μm或0.22μm滤膜过滤。Xtimate^® SEC可以使用水或有机溶剂与水的混合物，与大多数缓冲盐溶液也兼容。流动相使用前需脱气，否则可能出现柱压和基线波动较大。这时可用较大流速冲洗色谱柱2-5min，如对于7.8mm*300mm的色谱柱，可用1.25mL/min的流速。

色谱柱中不可避免会存在其他次级作用力，为了最大限度降低填料与被测物的次级作用力，必须调整流动相的离子强度。NaCl是SEC分离中比较常用的盐，可通过调整离子强度，减少次级作用力，进而改善峰形和分离效果。

流动相的pH调整，更多也是为了减少色谱柱中的次级作用对被测物的影响，所以测定过程中需选择合适的pH。为获得最佳分离效果和延长使用寿命，建议使用pH在2-7.5范围内的流动相。

尽管Xtimate^® SEC可在高至3000psi 的压力下使用，但正常的操作压力应当低于1500psi。长时间在高压下运行会损坏色谱柱和输液泵。由于压力来源于流速，因此最大流速将受制于系统所能承受的压力。一般而言，柱压会随着色谱柱使用时间的增加而逐渐增加。 

尽量采用低流速测试，可以提高分离度，进而获得更好的测试效果。内径为4.6mm和7.8mm的色谱柱，一般建议其正常操作流速分别为0.1-0.4mL/min和0.1-1.25mL/min。

通过增加色谱柱的长度可以改善SEC分离度，所以在分离过程中，在一根色谱柱达不到分离效果时，可以考虑两根色谱柱串联，甚至不同孔径的色谱柱串联（注：一般大孔径的在前，小孔径的在后）。这种条件下通常也会造成出峰时间延后，及系统压力增加。

最高操作温度为80℃。为了获得最长的使用时间，最佳操作温度为10-30℃。长时间在高温（>80℃）下操作也会损坏色谱柱，这种情形在高的 pH（>7.5）条件下尤其突出。

随着使用次数的增加，某些样品可能吸附到入口筛板或填料上。当积累到一定程度时会出现压力升高，并伴随峰形异常等现象。因此，日常使用过程中需要经常注意对色谱柱进行冲洗和维护，以达到最佳的分离效果和延长使用寿命。