自动化液质联用工作流程：采用 AssayMAP 技术进行溶液内蛋白酶解、肽段纯化以及肽段的强阳离子交换分馏

摘要

液质联用鉴定肽段的样品制备，通常由多步骤工作流程组成，包括溶液内蛋白酶解、肽段纯化，以及肽段分馏。该过程通常需要根据样品特性及分析目的（ 即定量或表征）定制为具体的应用方法。样品制备工作流程的自动化可提高样品处理能力、降低差异性，并且无需熟练操作人员执行重复工作。然而，自动化平台通常并不用于最初的分析开发，这是因为分析开发者很少具有开发复杂自动化方案的经验。相反，分析通常是采用湿式工作台相关技术进行开发，然后在自动化专家的帮助下移植到自动化平台。

采用 AssayMAP 肽段样品制备解决方案，无需掌握专门的技术也能实现自动化操作。开发者可通过一个简单的软件用户界面和灵活的实验方案对关键实验变量进行完全控制，从而能够专注于科学分析研究。如今，分析开发者、科学家或技术员无需具备自动化专业知识也能实现可扩展、精确的自动化操作。采用 AssayMAP 平台，整个工作流程可直接在相同的硬件上进行开发，如需实现高通量样品前处理，也易于对硬件进行扩展，从而可减少或避免已有实验方案实现自动化所需的额外时间和资源。本文将介绍发现（鸟枪法）蛋白组学研究的一种常规液质联用工作流程，包括溶液内酶解、反相肽段纯化，以及肽段的强阳离子交换分馏 (SCX)，所有这些操作均由 AssayMap Bravo 液体处理器完成。采用 SCX 小柱通过增加 pH 或离子强度对大肠杆菌蛋白裂解液进行逐步洗脱，在六个 SCX 馏分中鉴定出 15000 多条特定肽段序列，其中 64-67% 的肽段可专属性地在其中一个馏分中得到鉴定。

前言

自动化的样品制备工作流程具有诸多好处，包括可扩大样品处理规模以满足所需的通量要求，并且不需要熟练操作人员执行重复而苛刻的样品处理工作。在多步骤工作流程中，借助具有精确液体处理功能的自动化平台还能最大限度减少误差的传播，并实现重现性最大化。特别是在使用液质联用系统的蛋白和肽段分析中，因为这种先进的高精密度和灵敏度的分析仪器会将多步骤样品制备工作流程中的误差放大。然而，实现样品制备的自动化面临一个重大挑战，自动化平台往往用于对现有工作流程进行移植而不是直接基于自动化平台进行分析开发，这就需要额外的优化及资源配置，从而延迟了工作流程自动化的收益。对那些未接受过自动化平台专业培训的人员而言，自动化开发并不现实且过于严格。这种严格性对已完全开发的分析而言非常重要，但可能会阻碍开发过程，因为它要求分析开发者掌握自动化相关知识并且要投入大量时间以使自己成为自动化专家，否则需要依赖其他自动化专家协助完成分析开发。从分析开发者的角度而言，真正的自动化平台应当能够实现从头至尾的分析开发、将多步骤实验方案无缝地整合到已连接的工作流程中，并且分析人员无需掌握任何自动化专业知识，从而更加专注于科学分析研究而不是自动化过程。

安捷伦引进了 AssayMAP 肽段样品制备套件，包括用于 AssayMAP Bravo 自动化平台的相关软件和微型小柱，可直接满足分析开发者在自动化工作流程中进行液质联用蛋白组学应用的需求。该技术的核心是 AssayMAP Bravo 的精确液体处理能力，可处理微量滴定板。AssayMAP Bravo 移液头配有液体位移式 96 位探针式注射器 (250 μL)，可采用一次性 5 μL 填充床小柱实现严格流量控制的微量级色谱分析。当自动化工程师和液质联用分析科学家协作开发出适用于蛋白组学应用的高灵活性模块化方案后也带来更多的差异化创新。这些实验方案均呈现在一个简单易用的软件界面中，使得分析开发者能够对实验参数进行完全控制，而不需精通基本的自动化知识。从而可在自动化平台上实现湿式工作台类型的分析开发。AssayMAP 方案针对溶液内酶解、肽段纯化（脱盐）及肽段分馏进行开发。这些方案可作为独立的模块进行操作，或者对这些方案进行搭配，从而建立更加复杂的工作流程架构，实现各个方案之间的转换。

在本应用简报中，我们将介绍多步骤AssayMAP 工作流程在一种典型的发现（鸟枪法）蛋白质组学实验中的应用，其中采用大肠杆菌蛋白裂解物进行酶解、反相纯化，并通过增加离子强度或 pH 逐步进行强阳离子交换洗脱分馏。液质联用分析采用 Agilent 6550 iFunnel Q-TOF 液质联用系统、Agilent 1290 Infinity 液相系统及 AdvanceBio 肽图分析色谱柱，结果发现使用任一种分馏技术均可在大肠杆菌中鉴定出 15000 多条独特的肽段序列。在这 15000 条肽段中，约 10000 条肽段可在六种馏分中的一种馏分中专属性的识别出来，证实了AssayMAP SCX 小柱逐步分馏的有效性。重复分析说明利用精确的安捷伦分析技术进行蛋白组表征的液质联用工作流程具有高度重现性。

结论

用于肽段 LC/MS 分析的多步骤样品制备工作流程可通过 AssayMAP Bravo 实现自动化操作，从而获得高重复性的溶液内蛋白酶解、反相肽段纯化及复杂肽段混合物的强阳离子交换分馏。在原理循证的发现型鸟枪法实验中，采用 100 μg 大肠杆菌细胞裂解液蛋白样品进行多步骤的 AssayMAP 工作流程，其中通过增加离子强度或 pH 进行六个洗脱步骤以完成 SCX 分馏。两种形式的分馏均可鉴定超过 15000 条特有肽段，由 Agilent 6550 iFunnel QTOF液质联用系统、Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统及 Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱进行分析。在 15000 多条特有肽段中，采用离子强度或 pH 进行 SCX 分馏时，分别有 67.1% 和 64.2%的肽段可专属性地归至六个馏分中的一个。在未使用内标情况下，通过多天对选定肽段进行分析，结果表明峰面积 %CV 在 2.3-8.1% 之间。与未分馏的样品分析相比，采用 SCX 馏分可鉴定到接近两倍量的特有肽段，这表明，采用逐步分馏可提高分析的动态范围，提高发现型实验中的蛋白组覆盖率。

采用 AssayMAP Bravo 及其专为精确蛋白组学设计的工具套装可实现多步骤样品制备工作流程的自动化，实验设立简单易行。AssayMAP 肽段样品制备自动化解决方案可使研究人员及分析开发者快速、系统地评价 LC/MS样品制备条件、化学反应和方法学，而无需掌握自动化方面的专业知识。与此同时，一旦工作流程完成后，对于通量需求，无论是每天几个样品，还是每天上百个样品，AssayMAP Bravo 平台均可无缝进行通量缩放。这是因为它能够通过一个简单直观的软件界面定制方案，使用户可以完全控制重要的实验变量，而不再需要事先熟悉复杂的精确自动化知识。对于那些已经通过湿式工作台技术开发的样品制备方案，分析开发者可利用其在特定化学反应及实验条件选择和优化方面的投资，将实验方案扩展至 AssayMAP 平台。总的说来，本文展示的数据证实了采用 AssayMAP Bravo 进行自动化样品制备并利用安捷伦的分析方案对多肽进行 LC/MS 分析可获得高精度的测量结果。