从样品前处理到数据分析的单克隆抗体 N-连接糖链全面分析方法

前言

单克隆抗体 (mAb) 及其衍生物包含一类非常重要的生物分子，它们具有广泛的应用。由于 mAb 的异质性，必须对此类生物分子进行全面的分析表征。分析包括测定 mAb 及其异构体的完整氨基酸序列，以及糖基化、氧化和脱酰氨基化等翻译后修饰 (PTM) 的表征。

糖基化在许多生物过程中起着重要的作用。它还会对治疗效果、稳定性、药代动力学和免疫原性产生影响。糖链表征通常会涉及到 NMR、HPLC 或质谱 (MS) 等技术。由于糖链在组成和结构方面十分多样，并且很难采用电喷雾电离，因此基于质谱方法的糖链表征具有挑战性。InstantPC 是一种 ProZyme Inc. 推出的新型荧光标签，已开发用于改善 N-糖链分子的 MS 电离效果和检测灵敏度。

传统的糖链分析方法费时费力，而且步骤繁琐，首先通过 PNGaseF 酶解释放糖链（过夜），然后进行样品净化，通过还原胺化反应进行荧光标记（2-AB 或 InstantPC），最后在 LCFLD或 LC/MS 分析之前对释放的标记 N-糖链进行净化2,3。尽管使用荧光标签可显著提高 MS 灵敏度，但是手动样品前处理费时费力、重现性低以及不便扩大样品处理规模是生物制药行业面临的主要问题。

本研究展示了如何使用 AssayMAP Bravo 液体处理平台增加糖链表征工作流程的样品通量。该解决方案结合了 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统、Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱、安捷伦高灵敏度荧光检测器 (FLD) 以及 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF。Q-TOF 数据使用 Agilent MassHunter BioConfirm B.09.00 软件自动进行分析。该解决方案通过便捷的样品前处理、简化的数据采集和数据分析显著提高了效率，另外还可基于 FLD 或 MS 信号灵活进行定量分析，并从 N-糖链质量数数据库获得精确质量数峰归属结果。

结论

本研究展示了 Agilent AssayMap Bravo、6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 和 MassHunter BioConfirm 软件作为释放糖链分析集成解决方案的优异性能。

• 该工作流程在实现高通量样品前处理的同时，还使用 Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱获得优异的色谱分离结果

• BioConfirm B.09.00 包含的糖链数据库易于设置和使用，具有准确分析、鉴定和执行相对定量的功能

• 使用 6545XT 糖链分析能够生成与荧光分析相似的定量结果，可用于比较不同 mAb 样品之间的 N-糖链差异

• BioConfirm B.09.00 的报告生成器功能可以创建定制报告

总之，安捷伦的解决方案使 N-糖链分析从样品前处理到高精度数据分析的整个过程实现了自动化。该方法使用荧光和额外的质谱检测鉴定手段，为糖链分析提供了高灵敏度和最佳定量结果。