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重组蛋白表征——氧化分析
2018/08/02 16:37
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方案摘要：
产品配置单：
Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统
型号： 1290 Infinity II
产地： 德国
品牌： 安捷伦
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Agilent 1290 Infinity II Multisampler
型号： 1290 Infinity II Multisampler
产地： 德国
品牌： 安捷伦
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方案详情：
已有结果表明酶的氧化修饰会抑制酶的活性。同样，重组蛋白的氧化也可能导致功能丧失。因此在蛋白质药物的开发和生产中，需要对氧化反应进行密切监测，因为它能改变蛋白质药物的生物活性、半衰期和免疫原性。在加工和储存过程中，蛋白质中的氨基酸很容易被氧化，这些氧化必须受到连续监测。蛋白质上某些蛋氨酸残基可能被氧化成蛋氨酸亚砜甚至蛋氨酸砜。蛋氨酸的氧化能导致失活、聚集，以及增加免疫原性。天冬酰胺残基的去酰胺化形成天门冬氨酸和异天门冬氨酸是蛋白质降解的另一个重要原因，尤其在长期储存条件下容易发生。谷氨酰胺残基也能发生去酰胺化，其反应速度比天冬酰胺慢一百倍，很少在重组蛋白中检测到。色氨酸和半胱氨酸也可能发生氧化。
蛋氨酸氧化可以通过质谱或者紫外检测肽段的方式进行测定。包含氧化蛋氨酸的完整蛋白质和未氧化的完整蛋白质可以用离子交换色谱或疏水作用色谱(HIC) 分离，使用反相盐梯度，即从高到低的盐浓度梯度。天冬酰胺残基很容易去酰胺化，可以用重组蛋白的肽图分析进行鉴定。
一种测定蛋白质药物氧化难易性的方法是强制氧化研究。在这些研究中，将蛋白质暴露在温和的氧化剂中，常见的如过氧化氢或叔丁基过氧化氢(T-BHP)，以研究可能被氧化的位点和氧化对蛋白质药物活性的影响。在这样的一个研究中，使用安捷伦液相色谱- 芯片/QTOF 质谱系统分析了单克隆抗体被过氧化氢氧化的产物；采用BioConfirm 软件找出了单克隆抗体质量数的变化。随后对胰蛋白酶酶解生成的肽段进行MS 和MS/MS 分析，鉴别出了氧化修饰的位点。更重要的是，还需要测定氧化的程度和速率，液质联用在这方面是很有价值的工具。采用安捷伦6520 Q-QTOF 液质联用系统得到了出色的分离度和高度精确的肽段质量数，从而能够准确识别氧化肽段峰在单克隆抗体序列中的位置。MS/MS分析通过精确定位肽段中的氧化修饰位点，提高了肽段序列匹配的可信度。
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