在高 pH 下使用 Agilent Poroshell HPH-C18 色谱柱作为方法开发的工具

前言

开发出适合化学分析和药物分析的 HPLC 方法是一项极具挑战性的任务。为获得足够的分离度并实现稳定分离，涉及到对各种色谱参数的筛选。尽管开发方法的途径有很多，比如一次一因子实验法，以及质量源于设计 (QbD)，不过优化分离的目标和因子还是相同的。有很多因素影响色谱分离度 (RS)，如效率（N，取决于粒径、粒子形态以及色谱柱长度）、保留因子（k，取决于溶剂强度）和选择性（a，取决于键合相和流动相）的，其中选择性 a 是最重要的因素。

方法开发涉及到简单及复杂混合物的分离。选择性受固定相、有机改性剂类型、梯度斜率、流速以及温度等多个因素的影响。对于可离子化的化合物来说，缓冲液的pH 值也是一个重要参数。优化可离子化化合物的分离以寻找稳定条件已经成为液相色谱方法开发的重要组成部分。大部分制药和生物化合物都含有可离子化的官能团（如羧基或氨基）。在反相液相色谱(RPLC) 分离方面，使用pH 是一种增加选择性的有效工具。低pH 下可分离质子化的酸和碱，但是高pH 条件下这些酸与碱会去质子化。分析物在反相色谱上的保留很大程度取决于其电荷，因此可利用pH 使选择性发生较大的变化。在酸性pH 下，酸会呈中性，因此保留时间最长；碱由于完全带电荷而保留时间最短。在碱性pH下（高于化合物的pKa），碱则呈中性，因此保留时间最长；而酸会完全离子化使得保留时间最短。为了使碱性分析物在RPLC 上获得最佳的峰形、保留时间以及样品上样量，流动相的pH 至少应该比目标化合物的pKa 高两个单位。中性化合物的保留则不受pH影响。在本文中，使用专门设计的且在高pH 流动相中能保持稳定的Agilent Poroshell HPH-C18 色谱柱，通过pH 的调节来达到对选择性的控制。

结论

采用Agilent Poroshell HPH C18 色谱柱时，可利用pH 调整选择性，而且不会牺牲色谱柱在高pH 下的寿命。保持梯度不变而改变 pH，8 种酸、碱以及中性化合物的洗脱顺序会发生很大的变化，色谱分离度也因此会有所改变。在第二个实验中，使用普通梯度对pH 3 和pH 10 下的保留时间作图并确定相关系数。用R2 衡量正交性。我们发现两种pH 条件提供了不同的选择性。使用pH 作为方法开发的工具非常有效，尤其当样品含有酸性或碱性化合物时更是如此。我们还研究了高、低pH 下几种碱性化合物在梯度 HPLC 上的正离子电喷雾质谱特性。在本例中，我们发现碱性化合物的峰形得到了改善，而且保留时间也延长了。我们还发现，从峰面积角度来说，信号增强了。这一影响并非普遍现象，有可能与化合物有关。在任何情况下，碱类化合物在高pH 时的信号都没有变弱。最后，我们确定，在25 °C 下使用pH 10 的碳酸氢铵时，Poroshell HPH C18 色谱柱的使用寿命更长（可超过 2000 次进样）。在Poroshell HPH C18 柱上利用pH 作为方法开发的工具，色谱工作者可最大限度提高方法开发和分析的灵活性，而Agilent Poroshell 120 系列产品的耐用特性和长寿命也能让其从中获益。