使用 Agilent VistaFlux 对软骨肉瘤细胞系进行 13C-谷氨酰胺定性代谢流分析

摘要

在缺少动态信息的情况下，代谢组学数据的解读通常十分复杂，这是因为在相应代谢物丰度未发生改变时，某个通路的代谢流可能已经发生显著变化。稳定同位素示踪（ 定性代谢流分析）的巨大潜力有助于解决这些状况，以便更深入地了解生物系统。在定性代谢流分析中，将稳定同位素示踪剂（通常含有 13C、15N 或 2H）引入生物系统，导致下游代谢物的同位素模式（同位素异数体分布）发生改变。该方法尤其适用于易于引入稳定同位素示踪剂的细胞模型，对产生的标记模式及示踪剂掺入动力学的分析将提供对酶功能、途径依赖、基因表达和蛋白功能变化效应的洞察。

Agilent MassHunter VistaFlux 软件旨在设计一套完整的工作流程，帮助科学家进行定性代谢流分析，助于高分辨率准确质量数 TOF 和 Q-TOF LC/MS 数据的处理和可视化。软件提供的工具可进行特征提取、同位素掺入分析、同位素异数体丰度分析、天然丰度校正、统计学分析以及数据在通路中的可视化。

本应用简报展示了使用 13C5 - 谷氨酰胺(U-13C-Gln) 作为示踪剂，对软骨肉瘤细胞系进行定性代谢流分析的研究示例。采用安捷伦 LC/TOF 系统进行数据采集，并使用 MassHunter VistaFlux 进行数据分析和解析。研究证明了异柠檬酸脱氢酶 2 (IDH2)的突变对三羧酸循环代谢产生的影响，特别是突变的 IDH2 异构体将致使谷氨酰胺转化生成 2-羟基戊二酸 (2-HG)。

前言

近期，多种实体瘤和血液肿瘤中均发现了体细胞 IDH 突变，其中包括胶质瘤、急性髓性白血病和软骨肉瘤。异柠檬酸脱氢酶(IDH1/2) 的突变发生在酶的活性位点上，形成的功能获得性表型导致代谢物 2-羟戊二酸 (2-HG) 的生成能力提高。近期研究表明，IDH 突变细胞中 2-HG 的高水平累积与清除途径的饱和相关，因此 2-HG 成为了 DNA 脱甲基酶 TET 家族、组氨酸脱甲基酶 Jumonji C 家族、mRNA 脱甲基酶 FTO 和 ALKBH5 以及调节缺氧诱导因子 (HIF) 的脯氨酰羟化酶 (PHD) 等各种 α-酮戊二酸 (α-KG)依赖型加双氧酶的竞争性抑制剂。这些变化促进了抑制性染色质环境的形成，这种环境可将细胞锁定在未分化状态下。

软骨肉瘤是由软骨细胞沉积软骨引起的一种肉瘤，具有较高的 IDH 突变发生率。软骨肉瘤肿瘤来源细胞系的易得性使其成为了解 IDH 突变后果的实用模型系统。其中一项重要研究是使用定性代谢流分析来说明突变酶产生的 2-HG 来自 α-KG 和三羧酸循环中的谷氨酰胺。

结论

采用 Agilent MassHunter VistaFlux 工作流程，在 CS-1 软骨肉瘤细胞中以 U-13C-Gln 作为代谢示踪剂进行定性代谢流分析。该分析明确证实了 IDH2 突变异构体对谷氨酰胺衍生的 α-KG 到 2-HG 的转化活性。8 小时后，IDH 突变细胞中大部分 2-HG 组均被标记为 M+5 同位素异数体。IDH2 R172S 突变酶的新生变形活性超过了内源性 2-HG 脱氢酶，因此 2-HG 的生成量有所增加，从而使 2-HG 的累积浓度升高。因此，2-HG 成为了 DNA 脱甲基酶 TET 家族和组氨酸脱甲基酶 Jumonji C 家族等多种 α-KG 依赖型加双氧酶的竞争抑制剂，造成了包括 DNA 超甲基化在内的表观遗传学变化，促进了未分化染色质环境的产生。分析还展示了 U-13C-Gln 示踪剂进入经典三羧酸循环通路中的结果。与手动数据挖掘相比，VistaFlux 工作流程为稳定同位素示踪数据处理提供了全面、自动化且快捷的框架，其中包括同位素异数体提取和定性代谢流文件数据的通路可视化。