单细胞测序技术在植物科学研究中的应用

单细胞测序技术（Single-cell sequencing, SCS）是一种强大的分子生物学工具，它能够从单个细胞中提取基因组、转录组或其他组学信息，从而揭示细胞间的异质性、细胞状态的动态变化以及复杂生物过程中的精细调控机制。单细胞测序的核心原理包括单细胞的分离、细胞内核酸的扩增、测序以及数据分析等步骤（图1）。

图1 植物单细胞测序一般流程

数据分析的主要步骤包括数据预处理、特征选择、降维、聚类、细胞类型鉴定、差异表达分析以及细胞状态和轨迹推断等。以下是植物单细胞测序数据分析中的关键方法：

1. 数据预处理：包括基因表达矩阵的构建、低质量细胞和基因的过滤、数据归一化和批次效应的校正。

2. 特征选择：识别出表达量变化大，对细胞类型鉴定有重要作用的基因。

3. 降维和可视化：使用主成分分析（PCA）、t分布随机邻域嵌入（t-SNE）或均匀流形逼近和投影（UMAP）等方法进行降维，帮助可视化和理解高维数据。

4. 聚类分析：应用K-means、层次聚类、基于密度的聚类（如DBSCAN）等算法，将细胞根据表达模式分组，推断细胞类型。

5. 细胞类型鉴定：利用已知的标志基因或外部数据库进行细胞类型的注释。

6. 差异表达分析：比较不同细胞群体间的基因表达差异，识别特定细胞状态或功能的关键基因。

7. 细胞轨迹推断：通过伪时间分析等方法，揭示细胞状态变化的动态过程和发育路径。

植物单细胞测序技术的应用正在植物科学领域中快速发展，为理解植物生物学提供了前所未有的精度和分辨率，以下是植物单细胞测序在植物研究中的几个热门应用领域：

1. 发育生物学：通过分析不同发育阶段的单细胞转录组数据，可以识别出控制细胞命运决定的关键信号通路和转录因子，从而深入理解植物器官形成和组织发育的分子机制。

2. 基因表达异质性：植物单细胞测序揭示了即使在外表上看似均质的细胞群体中也存在着显著的基因表达异质性。这种异质性对于理解细胞如何响应环境变化、如何在不同生长条件下调节其功能至关重要。

3. 环境适应性和应激响应：通过分析植物在不同环境条件下的单细胞响应，研究人员可以识别出使植物适应逆境（如干旱、盐胁迫、低温等）的关键基因和调节网络，对于培育适应性更强的作物品种具有重要意义。

4. 植物-微生物相互作用：单细胞测序技术也可以揭示植物根部与不同微生物群落相互作用时的细胞特异性表达模式，有助于理解如何通过调节植物-微生物相互作用来提高作物的生长。

5.抗性机制：通过对健康和受病原体侵染的植物细胞进行单细胞测序分析，可以识别出与疾病相关的细胞类型，以及植物如何在细胞水平上激活抗性机制，这对于培养抗病品种具有重要意义。

植物学领域的单细胞测序研究相较于生命医学领域发展较慢，主要因为植物细胞制备的技术挑战较大，具体原因包括如下几个方面：

1. 植物细胞壁去除难度：植物细胞壁坚固，需在单细胞分离前移除。

2. 酶解引发应激反应：细胞壁消化过程可能诱发植物细胞的应激反应，造成转录偏差。

3. 原生质体体积不可控及渗透压变化：细胞壁消化后，原生质体体积和渗透压易受影响。

4. 细胞器和液泡的处理难度：植物细胞中的多种细胞器和液泡增加了制备复杂性。

5. 方案高度专一性：不同植物物种及器官需要特定消化方案。

6. 细胞类型的多样性：植物组织中细胞类型极其多样，其鉴定和分类比动物组织更复杂。

题目：Decoding the gene regulatory network of endosperm differentiation in maize

期刊：nature communications IF: 16.6 中科院一区

DOI: doi.org/10.1038/s41467-023-44369-7

发表时间：2024.02.02

第一完成单位：中国农业大学

主要研究内容：

该论文通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术构建了玉米胚乳发育过程中的单细胞转录组图谱，并鉴定了不同细胞类型之间的转录异质性。研究发现了12个细胞簇，对应五种胚乳细胞类型，并通过时间序列分析揭示了胚乳分化过程中的转录组动态变化。此外，通过ampDAP-seq技术对161个转录因子的DNA结合位点进行了大规模分析，构建了基因调控网络，并鉴定了181个调控子，包含转录因子及其高信度目标基因。研究还通过实验验证了三个预测的关键调控因子，为理解谷类（玉米）胚乳发育和功能提供了新框架。

图2玉米胚乳发育过程中的单细胞转录组图谱。a）玉米胚乳单细胞RNA测序（scRNA-seq）和簇标注流程。b）UMAP可视化显示玉米胚乳细胞的14个细胞簇。c）14个细胞簇中代表性细胞类型标记基因的表达模式。d）标记基因与细胞簇类型。e）标记基因的mRNA原位杂交结果验证细胞簇。f）玉米胚乳纵切图中细胞簇的空间分布。

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参考文献：

Bawa, G.; Liu, Z.; Yu, X.; Qin, A.; Sun, X. Single-Cell RNA Sequencing for Plant Research: Insights and Possible Benefits. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4497. https://doi.org/10.3390/ijms23094497

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