从实验室到生产线:固态光源技术在生物成像与工业检测中的性能提升
生物医学成像和工业计量的照明系统规格通常集中在光谱、空间和时间的光输出特性上。Lumencor的技术支持总监Iain Johnson和我们分享了固态光源阵列——LED、发光管和激光器组合成的固态光引擎如何实现规格定制,以满足特定应用的照明要求。
固态光引擎是一个集中控制的固态光源阵列,其输出合并到一个共同的光学传输系统中(图1)。光源的输出可以并行激活以产生白光(图2),或在需要分离的波长时,也可按顺序进行激活(图3、图4)。光源本身可以采用一种固态照明技术,即LED、光导管或半导体激光器,也可以对这些光源技术进行组合。这可以根据zui终用户的应用对亮度、角度分布和辐照度的要求进行定制。根据这一定义,光引擎输出的光谱分布可以通过加法组合,而这与传统的宽光谱照明设备(电弧放电和白炽灯)形成鲜明对比。传统的照明设备产生的光谱分布在物理上是不变的,只能通过选择性的阻挡和衰减来调整。从工程学的角度来看,固态光源的第二个主要优点是,它的输出可以在强度(图2、图4)和时间(图4、图5)方面进行精确控制。因此,光谱输出单元件的差异很小(图2),这使得光引擎应用于不同成像系统时,所获得的数据质量能保持一致。
图1.固态光引擎及其输出光谱的概念图。四个固态光源的输出被合并入一个共同的光路,并通过光导耦合进入纤维及或者图像扫描仪。在实际操作中,光源可以是2-21个,具体数量取决于应用要求。光源可以是LED、光导管或半导体激光器其中的一种或组合。它们的输出可以经过滤波(F)以细化光谱。输出光的一部分会被分离出来,并导向参考光电二极管(rPD),以提供控制反馈。
在大多数生物医学成像应用中,不需要持续照明,甚至在某些情况下,会起到反效果,影响实验数据。通常情况下,照明与相机曝光会同步进行。这里有两个重点:首先是光源间的切换速度,其次是脉冲间隔的复现性。相比和机械滤光轮耦合的白光照明器(约50ms的切换时间),光引擎可以做到小于1ms的光源间切换(图4),缩短了获取多色图像Z轴堆叠或者玻片扫描所需的时间。脉冲间的积分不变形(图5)是决定延时图像序列保真度的关键因素。每个脉冲的积分量化了在延时序列中每次曝光所需的照度。脉冲之间的照度差异越小,样品动态行为的敏感度就越能增加,这在图像帧到帧的变化间可以体现。
图2.28台SOLA V-nIR光引擎(Lumencor, Inc., Beaverton OR)的光谱输出曲线叠加。光引擎的总光输出由光谱曲线所包围的区域来量化。所有28台光引擎的平均输出功率为4558mW,标准差(n=28)为91mW,相当于2%的方差系数(CV)。
图3.SPECTRA光引擎(Lumencor, Inc., Beaverton OR)的光谱输出,包括LED、发光管或激光器。发光二极管和光导管的波长规格(nm)代表了中心波长(CWL)/半高全宽(FWHM),已经通过内置的滤光片来改进光源输出。功率(mW)是在光导(连接到显微镜或光学扫描仪)的远端测量得到的。
集成三种不同类型的固态光源,可以在整个可见光和近红外波段内提供均匀的功率输出。
图4.由TTL触发,AURA光引擎(Lumencor, Inc., Beaverton OR)交替输出485nm(约0.5ms宽)和560nm(约3ms宽)的脉冲(示波器记录)。图中显示了两条叠加的示波器轨迹,其中485nm的强度通过RS232串行命令从100%调整到55%,而560nm的强度保持不变。485nm和560nm的脉冲时间间隔为0.25ms。
图5.模拟光电二极管(APD)检测来自一台5光源的AURA光引擎(Lumencor, Inc., Beaverton OR)发出的5ms光脉冲。图中展示了10个脉冲序列,代表了每次数据采集中记录的150个连续脉冲。计算了150个脉冲序列中每个脉冲的积分光输出。对于555/28 nm输出,150个脉冲的方差系数(CV)在555/28 nm脉冲串中为0.23%,在635/22 nm脉冲序列中为0.20%。其他三个源通道的CV值相似(0.15-0.25%)。
除了光谱带宽(图3)以外,固态LED、光导管和激光器之间的主要区别在于其光输出的角度分布;LED和激光器之前的zui大区别如表1所示。对于宽场显微镜应用,LED光源配置为科勒照明产生的均匀照明,辐照度范围为1-100mW/mm2。然而,单分子定位显微镜(SMLM)需要更高的辐照度,通过链接到显微镜临界落射照明器(critical epilluminator)的CELESTA光引擎(Lumencor, Inc., Beaverton OR),可以在样品表明提供10^4mW/mm2的辐照度(图6)。临界照明的使用是由科勒照明在光学上的低效率所决定的,因为科勒照明并没有覆盖整个光源表面或者发射光的全部角度分布。在临界照明中,光源被直接成像到样品平面上,这种方法更为高效,但对光源输出中的任何空间不均匀性也更为敏感。临界落射照明器的作用是均匀化任何空间上的不均匀性,以产生与典型scmos相机传感器尺寸(~200mm2)相匹配的高辐照度照明场。
Light Source | Power(mW)① | light guide ② | Light Guide Cross Section | Area(mm2) | NA ③ | Etendue (mm2 sr)④ |
LED | 500 | Liquid light guide | Circle, 3mm dia | 7.07 | 0.30 | 2.00 |
Laser | 800 | multimode fiber | Square, 0.4*0.4mm | 0.16 | 0.22 | 0.02 |
表1. 光源比较
①输出功率是在指定光导的远端测量的
②使用光导将光源输出耦合到显微镜或光学扫描仪
③光导的数值孔径
④光通量积决定了光学检测系统有效利用光源输出的能力。当光源的光通量积与光学系统的光通量积紧密匹配时,可以获得zui佳性能。sr=球面弧度。
针对光驱动生物技术以及工业应用,优化光源的选择性需要全面考虑仪器的光谱、空间和时间要求,这些正是需要照明光源来支持的。通常一种技术尽可以满足其中的部分要求,所以zui佳策略即是混合多种技术来满足全部需求。复杂的光引擎可以提供这样一种集成的方法来混合光源,并克服任何给定技术的基本限制,例如,在荧光分析中,LED在500-600nm的光中由于臭名昭著的“绿色间隙”功率和亮度往往无法满足;或者相对于毫秒级的切换时间,任何弧光灯的开/关不稳定性;又或者广谱光源进行多路复用研究时,谱宽也带来了限制。如今各种固态光源各有优劣,只有仔细评估它们的优点与局限性,才能为光驱动生命和材料科学应用的广泛领域找到zui合适的照面解决方案。
图6.使用CELESTA光引擎(Lumencor, Inc., Beaverton OR),通过一根直径800um的光纤耦合到安装在尼康Ti/Ti2显微镜的临界落射照明器上,并产生均匀的荧光玻璃成像。使用尼康60/1.4 NA Plan Apo物镜和Andor的 Zyla 5.5 (2560 x 2160 pixels) scmos相机进行图像捕捉。图表显示了相机沿着标记为红色的对角线所记录的灰度值。右上角的插图展示了使用尼康10X/0.3 NA Plan Apo物镜成像的同一样品。
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