同济大学张国晟：南方某市水源水胞内、胞外抗性基因分布研究

新污染物治理列为全面推进美丽中国建设的重要内容，是当前生态环境工作新热点。新污染物种类繁多、性质各异，且在环境中存在的浓度往往极低，这要求检测技术必须具备更高的灵敏度、准确性和选择性。

近年来，随着科技的快速发展，新污染物的分析检测技术取得了显著进步。为了更好的展现新污染物分析检测技术的创新成果，以及了解目前行业发展的现状，仪器信息网特别策划《环境新污染物分析检测技术与行业进展》主题约稿活动，集中展示新污染物检测领域的最新成果，以下为同济大学张国晟老师回稿。

南方某市水源水胞内、胞外抗性基因分布研究

张国晟^1,2，谷纪元^1,2

（1.同济大学环境科学与工程学院，上海 200092；2.长江水环境教育部重点实验室，上海 200092）

作者邮箱：zhanggs371@163.com

1 引言

抗生素被广泛用于治疗细菌感染等疾病，但抗生素的滥用促进了抗生素耐药性细菌（antibiotic resistant bacteria, ARB）和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的增殖与传播^[1]，目前使用的大多抗生素都可以在环境中找到对应的ARB^[2]。中国是抗生素耐药性发生率最高的国家之一^[3]。ARGs是编码抗生素耐药性，是环境中广泛存在的一种新污染物，具有迁移转化途径复杂和种类多样等特点，对人类健康存在威胁，成为世界各地面临的日益严峻的挑战^[4]。ARGs可分为胞内抗生素抗性基因（intracellular antibiotic resistance genes，iARGs）和胞外抗生素抗性基因（extracellular antibiotic resistance genes，eARGs）。iARGs被认为是自然环境中ARGs的主要部分，而eARGs在水环境中占主导地位^[5]。由于河流系统中复杂的水质状况（抗生素、重金属、有机污染物等）形成的选择压力，与其他环境相比，河流系统有更多的机会实现ARGs的转移与运输^[5]。因此，本研究针对南方某河流开展调研，定量分析该河流中iARGs与eARGs的分布差异。

2 实验材料和方法

研究对象为南方某市给水厂水源水，采样时间为2024年1月。当场测定部分常规理化指标后，采集5 L样本并立即运送至实验室进行后续处理。

iARGs与eARGs分别按下述方法提取：5 L水样在负压抽滤下通过0.22 μm滤膜并收集滤后水。将滤膜浸泡在100 mL 含3%牛肉膏的溶液中，磁力搅拌30 min洗脱细菌。洗脱液以10000 g离心10 min，丢弃上清液。向沉淀中加入PBS使其重悬，用DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，货号DP712）提取DNA后，即得含iARGs的待测液。

向滤后水中加入pBR322质粒作为内参（终浓度约103 copies·L⁻¹），以50 mL·min⁻¹的流速通过装有核酸吸附颗粒（制备方法见参考文献^[6]）的滤柱，用100 mL洗脱液（15 g·L⁻¹氯化钠、30 g·L⁻¹胰蛋白胨、15 g·L⁻¹牛肉膏、3.75 g·L⁻¹甘氨酸，pH=9.3±0.2）洗脱，洗脱液通过0.22 μm过滤器后，加入等量异丙醇，室温静置16 h；再以13000 g离心10 min，弃去上清液，用70%乙醇重悬沉淀并重新以13000 g离心5 min；弃去上清液后，静置数分钟待乙醇充分挥发后，再加入1 mL TE缓冲液，即得含eARGs的待测液。

利用荧光定量PCR技术(qPCR)检测9种代表性的ARGs与1种用于介导ARGs传播的I型整合子，引物及ARGs靶向目标详见表1，所用仪器为ABI7500，反应试剂为TB Green® Premix Ex TaqTM II（Takara公司），终体系20μL。

表1 本研究所用引物

续表

3 实验结果和讨论

常规理化指标检测结果见表2，根据该市公布的检测结果，该水源为II类水体。

表2 常规理化指标

ARGs检测结果如图1所示，iARGs以相对丰度（iARGs与16s rRNA的绝对丰度之比）表示，eARGs以绝对丰度表示。

在iARGs中，9种待测ARGs均被检出。除常见的四环素类抗性基因(tetA、tetC)和磺胺类抗性基因(sul1、sul2)等被检出外，临床上用于治疗严重细菌感染的碳青霉烯类抗性基因blaIMP也被检出。其中blaIMP相对丰度最低，为1.03×10⁻⁶；其他ARGs的相对丰度变化较小，均约10⁻⁴~10⁻²。在提取到的iDNA中，I型整合子的相对丰度为10⁻⁶，表明在不同细菌之间存在一定频率的ARGs迁移与转化。

在eARGs中，除blaIMP未检出外其余8中ARGs均有检出，不同种类ARGs的丰度变化较大：sul2的丰度最高，为1.11×10⁸ copies·L⁻¹；katG的丰度最低，为1.69×10⁵ copies·L⁻¹。在提取到的eDNA中，I型整合子的丰度为1.36×10⁶ copies·L⁻¹，表明在该河流的不同细菌群落之间，同样存在一定频率的ARGs迁移与转化。

图1 南方某河流iARGs和eARGs丰度

4 结论与展望

水源水中存在的ARGs污染，除了来自上游污水厂的排放外，还可能来自沿途雨水的汇入^[7]。此外，河流中存在的抗生素污染也会促进细菌产生抗生素耐药性，进而导致产生ARGs污染。

已有研究表明，饮用水中存在的eARGs可影响小鼠肠道菌群并诱发肠道炎症^[8]。而饮用水厂通常并不能实现ARGs的有效去除，甚至可能促进ARGs的富集^[9]。因此，水环境ARGs污染所带来的健康风险应当引起重视，进行水体ARGs相关检测同样必要。这也对未来我国提高饮用水标准、改进自来水厂工艺措施以提高ARGs去除效果带来了新的挑战。

参考文献

[1]  Holm R, Söderhäll K, Söderhäll I. Accumulation of antibiotics and antibiotic resistant genes in freshwater crayfish–effects of antibiotics as a pollutant[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2023, 138, doi:10.1016/j.fsi.2023.108836.

[2]  Zhang T Q, Lv K Y, Lu Q X, et al. Removal of antibiotic-resistant genes during drinking water treatment: a review[J]. Journal of Environmental Sciences, 2021, 104(6): 415-429.

[3]  Zhao H Y, Zhang M, Bian J, et al. Antibiotic prescriptions among China ambulatory care visits of pregnant women: a nationwide cross-sectional study[J]. Antibiotics, 2021, 10(601), doi:10.3390/antibiotics10050601.

[4]  Hao H, Shi D Y, Yang D, et al. Profiling of intracellular and extracellular antibiotic resistance genes in tap water[J]. Journal of Hazardous Materials, 2019, 365: 340-345.

[5]  Yu W C, Xu Y, Wang Y W, et al. An extensive assessment of seasonal rainfall on intracellular and extracellular antibiotic resistance genes in urban river systems[J]. Journal of Hazardous Materials, 2023, 455, doi:10.1016/j.jhazmat.2023.131561.

[6]  Wang D N, Liu L, Qiu Z G, et al. A new adsorption-elution technique for the concentration of aquatic extracellular antibiotic resistance genes from large volumes of water[J]. Water Research, 2016, 92: 188-198.

[7]  Zhu Y, Liu Z S, Hu B L, et al. Partitioning and migration of antibiotic resistance genes at soil-water-air interface mediated by plasmids[J]. Environmental Pollution, 2023, 327, doi:10.1016/j.envpol.2023.121557.

[8] Tan R, Jin M, Chen Z S, et al.Exogenous antibiotic resistance gene contributes to intestinal inflammation by modulating the gut microbiome and inflammatory cytokine responses in mouse[J]. Gut microbes, 2023, 15(1), doi:10.1080/19490976.2022.2156764.

[9] Liu S S, Qu H M, Yang D, et al. Chlorine disinfection increases both intracellular and extracellular antibiotic resistance genes in a full-scale wastewater treatment plant[J]. Water Research, 2018, 136: 131-136.