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新污染物治理列为全面推进美丽中国建设的重要内容,是当前生态环境工作新热点。新污染物种类繁多、性质各异,且在环境中存在的浓度往往极低,这要求检测技术必须具备更高的灵敏度、准确性和选择性。
近年来,随着科技的快速发展,新污染物的分析检测技术取得了显著进步。为了更好的展现新污染物分析检测技术的创新成果,以及了解目前行业发展的现状,仪器信息网特别策划《环境新污染物分析检测技术与行业进展》主题约稿活动,集中展示新污染物检测领域的最新成果,以下为同济大学张国晟老师回稿。
南方某市水源水胞内、胞外抗性基因分布研究
张国晟1,2,谷纪元1,2
(1.同济大学环境科学与工程学院,上海 200092;2.长江水环境教育部重点实验室,上海 200092)
作者邮箱:zhanggs371@163.com
1 引言
抗生素被广泛用于治疗细菌感染等疾病,但抗生素的滥用促进了抗生素耐药性细菌(antibiotic resistant bacteria, ARB)和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的增殖与传播[1],目前使用的大多抗生素都可以在环境中找到对应的ARB[2]。中国是抗生素耐药性发生率最高的国家之一[3]。ARGs是编码抗生素耐药性,是环境中广泛存在的一种新污染物,具有迁移转化途径复杂和种类多样等特点,对人类健康存在威胁,成为世界各地面临的日益严峻的挑战[4]。ARGs可分为胞内抗生素抗性基因(intracellular antibiotic resistance genes,iARGs)和胞外抗生素抗性基因(extracellular antibiotic resistance genes,eARGs)。iARGs被认为是自然环境中ARGs的主要部分,而eARGs在水环境中占主导地位[5]。由于河流系统中复杂的水质状况(抗生素、重金属、有机污染物等)形成的选择压力,与其他环境相比,河流系统有更多的机会实现ARGs的转移与运输[5]。因此,本研究针对南方某河流开展调研,定量分析该河流中iARGs与eARGs的分布差异。
2 实验材料和方法
研究对象为南方某市给水厂水源水,采样时间为2024年1月。当场测定部分常规理化指标后,采集5 L样本并立即运送至实验室进行后续处理。
iARGs与eARGs分别按下述方法提取:5 L水样在负压抽滤下通过0.22 μm滤膜并收集滤后水。将滤膜浸泡在100 mL 含3%牛肉膏的溶液中,磁力搅拌30 min洗脱细菌。洗脱液以10000 g离心10 min,丢弃上清液。向沉淀中加入PBS使其重悬,用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司,货号DP712)提取DNA后,即得含iARGs的待测液。
向滤后水中加入pBR322质粒作为内参(终浓度约103 copies·L−1),以50 mL·min−1的流速通过装有核酸吸附颗粒(制备方法见参考文献[6])的滤柱,用100 mL洗脱液(15 g·L−1氯化钠、30 g·L−1胰蛋白胨、15 g·L−1牛肉膏、3.75 g·L−1甘氨酸,pH=9.3±0.2)洗脱,洗脱液通过0.22 μm过滤器后,加入等量异丙醇,室温静置16 h;再以13000 g离心10 min,弃去上清液,用70%乙醇重悬沉淀并重新以13000 g离心5 min;弃去上清液后,静置数分钟待乙醇充分挥发后,再加入1 mL TE缓冲液,即得含eARGs的待测液。
利用荧光定量PCR技术(qPCR)检测9种代表性的ARGs与1种用于介导ARGs传播的I型整合子,引物及ARGs靶向目标详见表1,所用仪器为ABI7500,反应试剂为TB Green® Premix Ex TaqTM II(Takara公司),终体系20μL。
表1 本研究所用引物
ARGs种类 | 序列(5’→3’) | 靶向目标 |
16S rRNA | F:CGGTGAATACGTTCYCGG R:GGWTACCTTGTTACGACTT | |
tetA | F:GCTACATCCTGCTTGCCTTC R:CATAGATCGCCGTGAAGAGG | 四环素类 |
tetC | F:GCGGGATATCGTCCATTCCG R:GCGTAGAGGATCCACAGGACG | 四环素类 |
续表
ARGs种类 | 序列(5’→3’) | 靶向目标 |
sul1 | F:CACCGGAAACATCGCTGCA R:AAGTTCCGCCGCAAGGCT | 磺胺类 |
sul2 | F:TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGG R:CGGGAATGCCATCTGCCTTGAG | 磺胺类 |
aadA | F:GTTGTGCACGACGACATCATT R:GGCTCGAAGATACCTGCAAGAA | 氨基糖苷类 |
rpoB1 | F:GGTCGCCGCGATCAAGGAGT R:GTGCACGTCGCGGACCTCCA | 利福平类 |
katG | F:GAAACAGCGGCGCTGATCGT R:GTTGTCCCATTTCGTCGGGG | 利福平类 |
dfrA1(1) | F:GGAATGGCCCTGATATTCCA R:AGTCTTGCGTCCAACCAACAG | 甲氧苄啶类 |
blaIMP | F: GGCGGAATAGAGTGGCTTAATTCTC R: CGTACGGTTTAACAAAACAACCACC | 碳青霉烯类 |
pBR322 | F:TTACCCCCATGAACAGAAATCC R:ATGTTAAGGGCGGTTTTTTCC | 内参基因 |
intI1 | F: CCTCCCGCACGATGATC R: TCCACGCATCGTCAGGC | I型整合子 |
3 实验结果和讨论
常规理化指标检测结果见表2,根据该市公布的检测结果,该水源为II类水体。
表2 常规理化指标
温度/℃ | pH | 浊度/NTU | 游离氯/mg·L−1 | 总氯/mg·L−1 | 电导率/μS·cm−1 |
17.2 | 8.49 | 3.6 | 0.08 | 0.13 | 319 |
ARGs检测结果如图1所示,iARGs以相对丰度(iARGs与16s rRNA的绝对丰度之比)表示,eARGs以绝对丰度表示。
在iARGs中,9种待测ARGs均被检出。除常见的四环素类抗性基因(tetA、tetC)和磺胺类抗性基因(sul1、sul2)等被检出外,临床上用于治疗严重细菌感染的碳青霉烯类抗性基因blaIMP也被检出。其中blaIMP相对丰度最低,为1.03×10−6;其他ARGs的相对丰度变化较小,均约10−4~10−2。在提取到的iDNA中,I型整合子的相对丰度为10−6,表明在不同细菌之间存在一定频率的ARGs迁移与转化。
在eARGs中,除blaIMP未检出外其余8中ARGs均有检出,不同种类ARGs的丰度变化较大:sul2的丰度最高,为1.11×108 copies·L−1;katG的丰度最低,为1.69×105 copies·L−1。在提取到的eDNA中,I型整合子的丰度为1.36×106 copies·L−1,表明在该河流的不同细菌群落之间,同样存在一定频率的ARGs迁移与转化。
图1 南方某河流iARGs和eARGs丰度
4 结论与展望
水源水中存在的ARGs污染,除了来自上游污水厂的排放外,还可能来自沿途雨水的汇入[7]。此外,河流中存在的抗生素污染也会促进细菌产生抗生素耐药性,进而导致产生ARGs污染。
已有研究表明,饮用水中存在的eARGs可影响小鼠肠道菌群并诱发肠道炎症[8]。而饮用水厂通常并不能实现ARGs的有效去除,甚至可能促进ARGs的富集[9]。因此,水环境ARGs污染所带来的健康风险应当引起重视,进行水体ARGs相关检测同样必要。这也对未来我国提高饮用水标准、改进自来水厂工艺措施以提高ARGs去除效果带来了新的挑战。
参考文献
[1] Holm R, Söderhäll K, Söderhäll I. Accumulation of antibiotics and antibiotic resistant genes in freshwater crayfish–effects of antibiotics as a pollutant[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2023, 138, doi:10.1016/j.fsi.2023.108836.
[2] Zhang T Q, Lv K Y, Lu Q X, et al. Removal of antibiotic-resistant genes during drinking water treatment: a review[J]. Journal of Environmental Sciences, 2021, 104(6): 415-429.
[3] Zhao H Y, Zhang M, Bian J, et al. Antibiotic prescriptions among China ambulatory care visits of pregnant women: a nationwide cross-sectional study[J]. Antibiotics, 2021, 10(601), doi:10.3390/antibiotics10050601.
[4] Hao H, Shi D Y, Yang D, et al. Profiling of intracellular and extracellular antibiotic resistance genes in tap water[J]. Journal of Hazardous Materials, 2019, 365: 340-345.
[5] Yu W C, Xu Y, Wang Y W, et al. An extensive assessment of seasonal rainfall on intracellular and extracellular antibiotic resistance genes in urban river systems[J]. Journal of Hazardous Materials, 2023, 455, doi:10.1016/j.jhazmat.2023.131561.
[6] Wang D N, Liu L, Qiu Z G, et al. A new adsorption-elution technique for the concentration of aquatic extracellular antibiotic resistance genes from large volumes of water[J]. Water Research, 2016, 92: 188-198.
[7] Zhu Y, Liu Z S, Hu B L, et al. Partitioning and migration of antibiotic resistance genes at soil-water-air interface mediated by plasmids[J]. Environmental Pollution, 2023, 327, doi:10.1016/j.envpol.2023.121557.
[8] Tan R, Jin M, Chen Z S, et al.Exogenous antibiotic resistance gene contributes to intestinal inflammation by modulating the gut microbiome and inflammatory cytokine responses in mouse[J]. Gut microbes, 2023, 15(1), doi:10.1080/19490976.2022.2156764.
[9] Liu S S, Qu H M, Yang D, et al. Chlorine disinfection increases both intracellular and extracellular antibiotic resistance genes in a full-scale wastewater treatment plant[J]. Water Research, 2018, 136: 131-136.
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