【应用】使用步琦中压制备色谱C-815高效分离纯化ω-3脂肪酸

简介

ω-3 脂肪酸是一类长链多不饱和脂肪酸，由于人体中缺乏 Δ−12 和 Δ−15 脱饱和酶，Ω-3 脂肪酸必须通过饮食获取，并且被认为对人类健康至关重要。EPA 和 DHA 的摄入量的增加已被科学证明在治疗和预防动脉粥样硬化、心肌梗死、炎症、关节炎、糖尿病、婴儿大脑发育和癌症方面有益。许多流行病学、观察性和临床研究强调了 ω-3 脂肪酸在降低血浆甘油三酯水平和预防心血管疾病方面的有效性。全球的心脏病学会建议每天服用 ω-3 脂肪酸（EPA+DHA 或仅 EPA）的剂量为 4 克（总EPA + DHA 超过 3 克），这代表了一种有效的降甘油三酯治疗剂。随着这一关注度的增加，对高纯度 ω-3 脂肪酸的需求激增。然而长期的过度捕鱼导致主要鱼类来源急剧下降，导致 ω-3 脂肪酸的价格迅速上涨。尽管如此，全世界只有少数公司有能力生产药用级 ω-3 脂肪酸。因此开发一种普遍适用且成本效益高的技术，以确保高纯度 ω-3 脂肪酸的安全生产是必要的。在本研究中，使用 RP-MPLC 技术来制备高纯度的 ω-3 脂肪酸乙酯，目标总含量不低于 84% 的 EPA 和 DHA，这是根据药典规定的。基本变量控制分离过程被评估和优化，基于纯度和回收率，包括填料材料、流动相、样品体积、样品浓度、流速和流动相组成。

色谱柱填料对分离效果的影响

色谱柱填料是色谱系统的“核心”，其物理化学性质，包括包装结构的均匀性（单相、多孔或非多孔）、几何形状（粒径、床面积和孔径及形状）以及所附接的配体类型，对分离效能有显著影响。为了寻找高通量、低背压、高灵敏度和高分辨率以实现高效分离的色谱柱填料，对多种键合相材料（CN、Diol、C4、C6、C8、C18 和 AQ-C18）在 ω-3 脂肪酸乙酯的纯化中进行了评估（见 图1 和 表1）

表1. AQ-C18 和 C18 对 RP-MPLC 纯化的 EPA 和 DHA 酯的影响。

注意：tR2 表示 EPA 的保留时间；tR3 表示 DHA 的保留时间；RS1 表示 EPA 与其前杂质（组分A）的分离度；RS2 表示 DHA 与其后杂质（组分D）的分离度。同一组中的不同字母表示显著差异 (p<0.05) 。以下表格同样适用此注释。

C18 和 AQ-C18 填充材料的洗脱曲线显示出 EPA 和 DHA 的明显目标峰，并且与相邻的杂质峰有良好的分离。AQ-C18 显示了较早的峰出现时间，较短的纯化时间和较低的溶剂消耗，与 C18 相比，这展示了更优越的分离效率。C18 和 AQ-C18 都是非极性反相色谱固定相，带有十八烷基碳链的硅胶。然而，AQ-C18 经历硅羟基的极性末端封口，减少了表面的残留硅醇，从而增强了 ω-3 脂肪酸乙酯的分离效果（见 图2）。因此，AQ-C18 被选为后续实验的固定相。

流动相对分离效果的影响

选择合适的流动相对于提高分离效率起着重要的辅助作用。低粘度、低沸点和低成本的溶剂被优先考虑。在 图3 和 表2 中，乙醇和乙腈在从 ω-3 脂肪酸中分离出杂质时效果不佳，而甲醇则成功了。尽管甲醇的粘度较高，但其较低的沸点使得从产品中除去甲醇，比乙腈和乙醇更容易。因此甲醇被选为首选的流动相。

表2. 不同流动相对 RP-MPLC 纯化 EPA 和 DHA 乙酯的影响。

流动相中有机溶剂的比例会改变其极性，从而影响样品组分在固定相中的分配系数，并影响分离效率。增加甲醇比例会推迟峰出现时间，使峰形变宽，并减少脂肪酸乙酯 EPA 和 DHA 的保留时间、分辨率以及纯度（见 图4 和 表3）。这是因为增加流动相的极性已被发现能够通过延迟非极性FAEE在柱中的保留时间来提高分离效率。当甲醇比例为 86% 至 90% 时，ω-3 脂肪酸的纯度逐渐下降；同时回收率提高。当甲醇比例达到92%时，EPA 和 DHA 的脂肪酸乙酯纯度降至 83.39%，这不符合国家药典标准。甲醇比例超过 90% 不利于制备高纯度的 ω-3 脂肪酸。因此选择 90% 的甲醇溶液作为流动相。

表3. 不同甲醇浓度对 RP-MPLC 纯化 EPA 和 DHA 乙酯的影响

上样体积对分离效果的影响

根据色谱制备的非线性理论，增加样品体积可以提高色谱的处理能力，提高产品回收率，并提高生产效率。如 图5 所示，随着负载体积的增长，保留时间延迟，峰形变宽，分辨率降低，纯化时间增加。这可能是因为更多的杂质在 AQ-C18 填料上吸附，影响了主峰和杂质峰的分离，从而降低了目标物质的纯度。当样品体积为 0.6mL 时，EPA 和 DHA 峰的总乙酯回收率最高(83.57%)。为了在实现更好的分离效果的同时最大化负载体积，选择了 0.6mL 的样品负载量，相当于色谱柱 1.25% 的柱体积。

表4. 不同上样体积对 RP-MPLC 纯化 EPA 和 DHA 乙酯的影响

样品浓度对分离效果的影响

在工业生产中，增加样品的浓度可以增强色谱处理能力，而降低浓度有助于促进分析物向色谱填料材料的分配和吸附过程，从而提高目标物质与杂质的分离度。然而这种改进是以相应的回收率降低为代价。图6 展示了不同浓度的鱼油乙酯与甲醇混合的 RP-MPLC 色谱曲线，并附 表5。随着鱼油乙酯浓度的增加，EPA 和 DHA 乙酯的纯度下降，而回收率、保留时间和分辨率表现出增加。相反，使用纯鱼油注射降低了 EPA 和 DHA 乙酯的分离因子，实现了 1.23 的前杂质分离因子和 1.10 的后杂质分离因子，纯度为 85.75%。EPA 和 DHA 乙酯的回收率随着样品的浓度稳步增加，达到纯鱼油时的峰值 74.62%。为了最大化生产效率，选择了纯鱼油乙酯。

表5. 不同浓度对 RP-MPLC 纯化 EPA 和 DHA 乙酯的影响

流速对分离效果的影响

在液相色谱系统中，增加流速可以缩短分析物的洗脱时间，但可能会降低色谱分析的稳定性。随着流速的增加，分析物的洗脱时间提前，峰形变得更加紧凑，导致乙酯 EPA 和 DHA 的峰与周围杂质峰的距离更近（图7）。随着流速的加快，EPA 和 DHA 乙酯的洗脱时间持续缩短，导致保留时间和分辨率降低，从而纯度下降（表6）。此外，EPA 和 DHA 乙酯的回收率也随着流速的增加而持续下降，这可能是因为过高的流速可能会阻碍目标化合物的吸附到固定相。为了优化分离效率同时减少时间和溶剂的使用，选择了 30mL/min 的流速。

表6. 不同流速对 RP-MPLC 纯化 EPA 和 DHA 乙酯的影响

ω-3 脂肪酸乙酯纯化后的脂肪酸分析

含有相当于色谱柱体积 1.25% 的鱼油乙酯被引入装有AQ-C18 填料的 RP-MPLC 柱（粒径 20-40 微米，孔径100Å，表面积 320−340m²/g），并用 90:10（体积比）的甲醇-水溶液作为等度流洗脱剂，流速为30mL/min，操作压力为 1-4bar，步琦 Pure Flash C-815 中压制备色谱。在最佳纯化条件下，鱼油乙酯的 RP-MPLC 色谱图如图8所示。收集了 B 和 C 两个馏分，并在减压下浓缩，随后通过 GC-MS 进行鉴定。总共鉴定出16种脂肪酸，以 2.39% 的单不饱和脂肪酸（SFA）、3.14% 的多不饱和脂肪酸（MUFA）和94.47% 的饱和脂肪酸（PUFA）的形式存在（图9和表7）。与初始样品相比，去除了 SFA C14:0、C15:0 和 C19:0；MUFA C24:1n9；以及PUFA C22:5n3、C20:3n6和C22:5n6。ω-3 PUFA 的比例从 78.59%上升到 90.34%，主要成分是 EPA 和 DHA，分别占 57.13% 和 28.14%，总计 85.27%。因此，通过 AQ-C18 RP-MPLC 纯化的 ω-3 脂肪酸乙酯符合《2020 年药典》中“乙基多烯酸”的标准，该标准规定 EPA 和 DHA 的含量至少为 84%。

表7. 纯化 ω-3 脂肪酸乙酯的脂肪酸组成

实验结论

通过使用 AQ-C18 色谱柱和步琦 Pure Flash C-815 中压制备色谱，获得了总 EPA 和 DHA 含量为 85.27%，回收率高达 74.30% 的 ω-3 脂肪酸乙酯。鱼油样品注射量为柱体积的 1.25%；以(90:10,v:v)的甲醇-水溶液作为流动相，以 30mL/min 的流速进行等速洗脱，操作压力为 1-4bar。与 RP-HPLC 相比，虽然两种方法生产的 EPA 和 DHA 乙酯纯度均符合国家药典标准，RP-MPLC 允许更大样品的装载量、更高的流速和更低的系统压力，从而缩短了纯化时间、提高了生产效率并降低了生产成本。

参考文献

1. Sang, M.; Pan, N.; Wu, J.; Chen, X.; Cai, S.; Fang, H.; Xiao, M.; Jiang, X.; Liu, Z. Reversed-Phase Medium-Pressure Liquid Chromatography Purification of Ω-3 Fatty Acid Ethyl Esters Using AQ-C18. Mar. Drugs 2024, 22, 285. https://doi.org/10.3390/md22060285