探索寡核苷酸杂质分离
Shim-pack Scepter Claris色谱柱
具有治疗潜力的核酸和mRNA疫苗在制药工业成为新的增长点。其中寡核苷酸发展迅猛,寡核苷酸是由20到60个碱基组成的单链或双链核酸片段。包括反义寡核苷酸(ASOs)、小干扰RNA (siRNA)、microRNA以及适配体。在生物化学、分子生物学和遗传学中有着广泛的应用。
寡核苷酸由于细胞外稳定性低,溶剂被核酸酶解,同时难以进入细胞等因素的影响发展缓慢,近些年,由于核酸修饰(磷酸骨架,碱基以及糖环的修饰)以及递送介质(脂质体等)等相关技术的突破,使其成为继小分子药物、抗体蛋白质药物之后,出现的一类新模式药物,是近年药物开发的热点之一。
寡核苷酸的结构决定了它极性非常强,在常规的反相色谱柱上很难保留,可以使用HILIC模式、离子交换模式或者借助于离了对试剂在反相柱上实现保留,不同分离模式各自有自己的局限性。IP-RP作为其中最常用的一种,应用范围最广,今天我们从方法开发的角度一探究竟。
Part 1
方法初筛
不同离子对试剂的选择对于物质的保留差异较大。此次分析的样品是20个碱基的寡核苷酸,优先选择TEA作为离子对试剂,后期因为涉及进质谱进行质量确认,所以加入了100mmol的HFIP增加灵敏度。采用不同比例的有机相、结合不同浓度的缓冲盐浓度,优化色谱方法,得到24张色谱图,叠加如下文图1所示。
整体色谱柱峰形优异,惰性化柱管对于因柱管导致的峰形拖尾等问题,改善明显。
从②⑤⑧可以看出,随着离子对试剂浓度的增加,保留提升,分离得到进一步的改善。
HFIP浓度以及有机相的比例会影响基线,200mmol/L的HFIP中有100%纯乙腈流动相会引起基线的抬升,比如⑬, ⑯, ⑲和㉒的实验结果。对比结果⑧和结果⑳,可以看出HFIP的提升,对于分离展现出不同的效果。此外,在一些文章中也提到需要在流动相中加入一定比例的HFIP,这样使得TEA的溶解度变小, 因而TEA更容易绑缚在固定相上形成更稳定的离子对试剂层 。这促使离子相互作用的分离机制非常显著,尤其针对于硫代寡核苷酸。
从②③的实验结果可以看出,不同的有机试剂含量对于杂质分离展现不同的选择性。不同流动相HFIP和TEA中的浓度、以及有机溶剂乙腈与甲醇的混合比例对FLP和FLP相关杂质分离影响较大。
最终,通过矩阵设计,考察分离效果,结果表明实验条件⑤的分离效果最佳,采用的流动相条件为:100mM HFIP 10mM TEA/ACN 50%_MeOH 50%。
Part 2
方法优化
文献中提到升高的柱温通常减小峰宽,从而一定程度上改善了杂质分离,因此也是主要的一个影响因素。Scepter Claris C18色谱柱采用杂化硅胶,不仅具有杂化硅胶可以耐受高柱温的特性,而且Scepter Claris色谱柱采用生物惰性涂层,相比于其他柱管的惰性化程度,惰性更优,峰形改善更明显。所以,进一步优化如图3所示,柱温65℃的峰展宽更弱,峰形更窄。
完整实验结果请查看“岛津实验器材”微信公众号
或直接访问:
https://mp.weixin.qq.com/s/NIT32ALeXXVa0t17JJ66uw
采用岛津Nexera XS inert 系统,配套岛津全新卓越惰性杂化硅胶色谱柱——Shim-pack Scepter Claris C18,从流动相比例、梯度、柱温等方面优化方法,避免了不锈钢柱管吸附导致的峰形问题,有效实现寡核苷酸的分离分析。结合LabSolutions MD可实现整个工作流程优化自动化,包括生成分析进度表、如自动峰值跟踪具体的数据处理功能、色谱的评价值和设计空间等,有效提升方法开发的效率。
产品目录
《岛津Shim-pack Scepter系列液相色谱柱》
点击立即查看最新药斯卡排行榜
[来源:岛津(上海)实验器材有限公司]
2024.08.19
2025年版《中国药典》公示稿|黄芪和槟榔中赭曲霉毒素A测定解决方案
2024.08.12
2025年版《中国药典》农药残留通则公示稿增修订梳理及整体解决方案上篇
2024.08.06
2024.07.29
2024.07.15
版权与免责声明:
① 凡本网注明"来源:仪器信息网"的所有作品,版权均属于仪器信息网,未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用。已获本网授权的作品,应在授权范围内使用,并注明"来源:仪器信息网"。违者本网将追究相关法律责任。
② 本网凡注明"来源:xxx(非本网)"的作品,均转载自其它媒体,转载目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责,且不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。如其他媒体、网站或个人从本网下载使用,必须保留本网注明的"稿件来源",并自负版权等法律责任。
③ 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起两周内与本网联系,否则视为默认仪器信息网有权转载。
谢谢您的赞赏,您的鼓励是我前进的动力~
打赏失败了~
评论成功+4积分
评论成功,积分获取达到限制
投票成功~
投票失败了~