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多重数字PCR活菌检测：naica®数字PCR系统助力霍乱弧菌活菌绝对定量
导读
毒性霍乱弧菌血清群O1和O139是导致全球霍乱流行的病原体。霍乱弧菌可在水中存活，并通过粪-口途径传播。提升快速准确监测环境水体中霍乱弧菌的能力是预防和控制霍乱传播的重要战略。传统的平板计数法被广泛用于霍乱弧菌的检测，是检测的“金标准”，但需要较长的时间和精力。因此，快速准确新检测方法的开发是必要的。
文献解读：
福建省疾病预防控制中心于Frontiers in Microbiology（影响因子IF：5.2）发表了名为《Absolute quantification of viable Vibrio cholerae in seawater samples using multiplex droplet digital PCR combined with propidium monoazide》的研究论文，开发了一种新的检测方法，将三重数字PCR（dPCR）与单氮化丙啶（PMA）处理相结合，定量检测活霍乱弧菌O1/O139和霍乱肠毒素（ctxA）。在模拟海水样品中评价了PMA-dPCR检测活菌源DNA的特异性和敏感性。
应用亮点
▶ 与传统的细菌培养方法相比，数字PCR技术更省时省力、灵敏度和特异性高、抗干扰能力强。
▶ 使用PMA结合qPCR计数VBNC状态下的霍乱弧菌O1，在同时检测或区分活霍乱弧菌O1和O139以及了解ctxA基因的携带状态方面仍存在局限性，与之相比，使用PMA结合dPCR技术的灵敏度和特异性都更好。
文章相关结果：
dPCR检测中，rfb O1、rfb O139和ctxA的最佳引物浓度分别为1μM，而三种探针的浓度分别为0.25、0.25和0.4μM。最佳退火温度为58°C，以获得最准确的结果。从PMA处理中区分活死细菌的最佳策略是在20 μM浓度下孵育15min，然后暴露于650w卤素灯20 min。
图例说明：不同PMA浓度处理后的死菌(A) /活菌(B) 及不同光照时间后死菌的(C) qPCR结果。ΔCt=对照组PMA-Ct值-处理实验组的Ct值。NT：未经PMA处理的对照组
在纯培养溶液中，霍乱弧菌O1、O139和ctxA的检测限（LODs）分别为127.91 CFU/mL、120.23 CFU/mL和1.5拷贝/反应，而海水样品中三个靶标的LODs分别为150.66 CFU/mL、147.57 CFU/mL和2拷贝/反应。
图例说明：不同PMA浓度处理后的死菌(A) /活菌(B) 及不同光照时间后死菌的(C) qPCR结果。ΔCt=对照组PMA-Ct值-处理实验组的Ct值。NT：未经PMA处理的对照组
在纯培养溶液中，霍乱弧菌O1、O139和ctxA的检测限（LODs）分别为127.91 CFU/mL、120.23 CFU/mL和1.5拷贝/反应，而海水样品中三个靶标的LODs分别为150.66 CFU/mL、147.57 CFU/mL和2拷贝/反应。
图例说明：使用三重dPCR同时检测霍乱弧菌的两个或三个靶点
图例说明：采用平板计数、qPCR、PMA-qPCR和PMA-triplex dPCR定量不同比例活菌下的霍乱弧菌O1和O139
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