华南农大刘健华教授课题组|利用纳米孔测序技术首次在蔬菜中发现新型多重耐药质粒

碳青霉烯类抗生素被认为是抗击多重耐药（MDR）的革兰阴性病原体的最有效药物。然而，碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌目细菌（CRE）的出现和快速传播对公共卫生构成了严重威胁。其中，新德里金属-β-内酰胺酶（NDM）是碳青霉烯酶的主要类型，可水解几乎所有β-内酰胺类药物，并已在全球大多数国家和地区广泛传播。

目前已经发现59种NDM酶，其中NDM-5是大肠杆菌中最主要的NDM酶。bla_NDM-5基因可以被多种质粒介导转移，其中IncX3型质粒是最重要的传播载体，而bla_NDM-5阳性多重耐药IncHI2型质粒的出现，进一步促进了bla_NDM-5基因在不同生态位菌株中的传播。

新鲜蔬菜被认为是耐药基因(Antibiotic-ResistantGenes,ARGs)重要的“储存库”。日益上涨的即食蔬菜消费量需求也增加了人类通过食物链接触抗生素耐药细菌（Antibiotic-ResistantBacteria,ARB）的可能性。目前，已在蔬菜源肠杆菌科细菌中发现了多种重要的ARGs，包括bla_CTX-M、mcr-1、tet(X4)、bla_KPC和bla_NDM。鉴于蔬菜通常未经加工或加工程度极低，ARB/ARGs有可能从蔬菜直接传播给人类，并对人类构成威胁。因此，持续监测新鲜蔬菜中的CRE对保障食品消费者的健康至关重要。

在中国，CRE已经在医学临床、食品动物、环境、零售肉类和伴侣动物中得到了很好的研究，但蔬菜源CRE仅有零星的研究，且主要集中在华东地区，而年平均气温较高的华南地区蔬菜源CRE的流行情况尚缺乏系统研究。

本研究旨在调查华南地区即食蔬菜中bla_NDM-5阳性肠杆菌科细菌的检出率，研究人员从广州菜市场采集的185份蔬菜样本中获得8份（4.3%）bla_NDM阳性样品，阳性率高于之前在华东地区的研究（2.4%），但低于缅甸蔬菜中的阳性率（28.1%）。

随后，研究团队基于齐碳纳米孔测序平台长读长优势并结合二代测序对阳性样本进行全基因组测序分析，对携带bla_NDM-5基因的菌株和质粒展开进一步的研究，发现了bla_NDM-5基因出现在p0111和IncHI2/ST2型质粒中，并对bla_NDM-5阳性IncHI2/ST3型质粒特征进行分析。

1.细菌分析与鉴定

从8个（4.86%）蔬菜样本中共分离获得9株bla_NDM基因阳性菌株（7株大肠杆菌和2株葡萄牙柠檬酸杆菌)，其中8株携带bla_NDM-5基因，1株携带bla_NDM-1基因（表S1）。进一步的抗菌药物敏感性测试表明，9株bla_NDM阳性菌均呈现多重耐药性，包括对β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类和氟喹诺酮类等多种药物耐药。

Table 1 Characteristics of bla_NDM –positive Enterobacteriaceae isolates from vegetables, China

MLST分型结果显示，两株葡萄牙柠檬酸杆菌不可分型，7 株bla_NDM-5阳性大肠杆菌属于不同的ST型，包括 ST10、ST93、ST206、ST746、ST6736、ST7058 和 ST7458。ResFinder分析显示，所有bla_NDM阳性菌均携带多种耐药基因或重金属耐药基因簇（表 1）。

2.质粒鉴定与特征分析

9株bla_NDM阳性分离株中，有8株bla_NDM 基因可通过接合试验转移至受体菌中，其中4株菌中bla_NDM基因位于在IncX3质粒上，另外4株菌中位于在IncHI2质粒上，仅有1株大肠杆菌（GDSC2239PM）中bla_NDM-5基因不可水平转移。

利用齐碳纳米孔测序平台结合二代测序平台获得了9个bla_NDM基因阳性质粒的完整序列，包括4个IncX3型质粒（pHN1BY3H-1、pHN2BY3H-1、pHNGDSC2239TM-1、pHNGDSC2241-1）、3个IncHI2/ST3型质粒（pHNBY4H-1、pHNGDSC2227-1、pHNGDSC1999-1）、1个IncHI2/ST2型质粒（pHNBY4G-1）和1个p0111型质粒（pHNGDSC2239PM-1），并通过BLAST对上述质粒做进一步的相似性分析。

结果显示，IncX3型质粒与其他已报到的质粒结构相似。3个bla_NDM-5阳性IncHI2/ST3质粒均携带多种耐药基因，其结构与中国广东鸭源大肠杆菌质粒pNDM33-1、安徽省鸡源肺炎克雷伯菌质粒pHNAH212836K、广东省人源大肠杆菌质粒pEC6622-1高度相似。IncHI2/ST3质粒中bla_NDM-5的基因环境均高度相似，都是在转座子Tn7051的结构基础上，通过多种插入序列的插入、缺失、倒置后形成。

Fig. 1 Genetic features of bla_NDM-5-carrying IncHI2/ST3 plasmids.

IncHI2/ST2型质粒pHNBY4G-1与美国牛肉源和越南鸡源质粒的序列相似度最高，但未检索到bla_NDM基因阳性的IncHI2/ST2质粒。质粒全序列分析，推测质粒pHNBY4G-1中bla_NDM-5基因可能是通过IS26、ISKpn19、∆Tn2、∆Tn3等多个插入序列和转座子的同源重组事件后获得。类噬菌体质粒p0111质粒pHNGDSC2239PM-1中可变区结构与IncHI2/ST3型质粒pHNGDSC1999-1中的相似，推测可能是由2个同向的IS26产生的环状中间体介导整合至p0111质粒中。

Fig. 2.Complete sequence of bla_NDM-5-carrying IncHI2/ST2 plasmid pHNBY4G-1

(a) Comparison of blaNDM-5-carrying IncHI2/ST2 plasmid pHNBY4G-1 with other similar plasmids.

Fig. 2.Complete sequence of bla_NDM-5-carrying IncHI2/ST2 plasmid pHNBY4G-1

(b)Genetic environment of blaNDM-5 in pHNBY4G-1.

Fig. 3 Comparison of plasmid pHNGDSC2239PM-1 with p0111 plasmids and bla_NDM-5-carrying-IncHI2/ST3 plasmids.

为了进一步明确蔬菜源bla_NDM-5阳性IncHI2质粒的来源，课题组将研究中发现的4个IncHI2质粒与从NCBI的nt和Assembly数据库中获得的50个bla_NDM阳性IncHI2质粒，基于核心基因组的SNPs构建进化树，并通过hierBAPS对质粒进行分类，结果显示54个bla_NDM阳性IncHI2质粒分为三个支系（1级聚类）（图4）。

3个蔬菜源bla_NDM-5阳性IncHI2/ST3质粒均属于3d亚支系，该亚支中所有IncHI2质粒均携带bla_NDM-5基因，首先在中国广东省鸭大肠杆菌中检测到，并主要在广东省食品动物源肠杆菌中检出。2020年后，在中国安徽省的鸡和浙江省的零售鸭肉中也出现了bla_NDM-5阳性IncHI2/ST3。另外，从广东病人源大肠杆菌中也检测到了类似的IncHI2/ST3质粒（pEC6622-1，CP096588），这意味着携带bla_NDM-5的IncHI2在人类、动物和食物链中广泛传播。

Fig. 4.Genetic relationships between the bla_NDM-carrying IncHI2 plasmids.

新鲜蔬菜是耐药基因重要的储存库，是耐药基因向社区传播的重要途径。

目前越来越多的研究在蔬菜中检测到CRE的存在。在这项研究中，从185个蔬菜样本中鉴定出8个（4.3%）携带bla_NDM基因的样品，高于之前中国东部地区的蔬菜中bla_NDM基因的检出率（2.4%），但低于缅甸蔬菜源bla_NDM的检出率（28.1%）。该研究分离获得1株同时产Tet(X4)和NDM酶的大肠杆菌，虽然这种菌株在我国食用动物中广泛存在，但在蔬菜中还是首次报道。

这项研究发现，IncX3和IncHI2型质粒是bla_NDM基因的主要载体。IncX3作为bla_NDM-5基因重要的传播载体，已经广泛分布于世界范围内的人类、动物和环境中。值得注意的是有3株菌中bla_NDM-5基因位于在多重耐药的IncHI2/ST3型质粒上，尽管类似的质粒已经在鸭、猪、鱼、零售肉、鸡和零售鸡蛋中报道，但这种质粒在蔬菜中尚未报道。携带bla_NDM-5基因的IncHI2质粒可能已经从中国广东省的鸭源大肠杆菌向不同来源的菌种以及中国其他地区（安徽、浙江）扩散。此外，课题组之前的研究发现，在中国安徽省的养鸡场中，IncHI2质粒甚至取代了IncX3质粒，成为bla_NDM基因最主要的传播载体。研究结果进一步表明，必须加强对IncHI2质粒的监测，全面评估IncHI2质粒在bla_NDM传播中的作用。

与IncHI2/ST3和IncHI2/ST1型质粒是多种碳青霉烯类耐药基因的载体不同，目前尚未在NCBI数据库中发现携带碳青霉烯类耐药基因的IncHI2/ST2型质粒。IncHI2/ST2型质粒可携带多种ARGs，如bla_CTX-M-55、floR、qnrS1、mcr-3和tet(X4)等（表S3），主要在美洲、亚洲和大洋洲的食品动物、食品和人类来源的沙门菌属和大肠杆菌中检测到。IncHI2/ST2质粒捕获bla_NDM-5基因可能会促进bla_NDM-5在沙门菌属中的水平传播和有助于bla_NDM-5基因的进一步传播。

该研究成果是刘健华教授课题组在耐药菌传播方面研究取得的新进展。研究团队利用齐碳纳米孔测序平台长读长测序技术优势结合二代测序，首次在蔬菜大肠杆菌菌株中发现了携带bla_NDM-5的IncHI2/ST3质粒，并报道了新型bla_NDM-5质粒载体IncHI2/ST2和类噬菌体p0111型质粒。

bla_NDM-5阳性的IncHI2/ST3型质粒在环境、食品动物、人等不同生态位中的广泛传播令人担忧，对食品安全和公众健康构成潜在的威胁。刘健华教授课题组的研究成果提示我们，尤其是在新鲜蔬菜中应进一步加强对抗菌药物耐药病原体的全面监测，以践行保护消费者从农场到餐桌健康的“OneHealth”理念。

特别鸣谢刘健华教授课题组的专业指导。