iMeta | 齐碳纳米孔测序助力揭示桑黄多酚抗结肠炎肠道分子机制

炎症性肠病（IBD）主要包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），是一个全球性的健康问题，影响全球约0.5%人口。IBD的典型症状包括急性腹泻、间歇性腹痛、直肠出血和体重减轻。除了显著降低生活质量外，IBD还增加了结肠癌的患病风险，从而给个人和社会带来了沉重负担。目前，IBD缺乏明确的治疗药物，虽然常用临床药物具有较高的缓解率，但往往会出现继发性失败。因此，迫切需要寻找更有效、更安全的新的治疗干预措施。

越来越多的证据证明了肠道菌群失调与IBD 的发生发展内在联系。Machiels等人发现，UC患者肠道微生态失调表现为产丁酸盐物种，如Roseburia hominis和Faecalibacterium prausnitzii的显著减少。丁酸钠治疗可减轻结肠炎的炎症状态和肠黏膜病变。吲哚衍生物是重要的微生物代谢物，已被证实是改善实验性溃疡性结肠炎的有益药物。例如，吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚-3-甲醇（I3C）和吲哚-3-丙酮酸（IPA）可以作为芳基烃受体（AhR）的天然配体，通过提高血清和组织抗炎白细胞介素水平来减轻IBD。因此，肠道菌群及其代谢产物，特别是吲哚衍生物，可能是开发新的抗IBD治疗干预措施的有效途径。

中药（TCM）在中国已成功治疗疾病数千年。越来越多的证据强调了天然药物资源的药理益处。食药用食物已成为一种很有前途的疾病治疗方法。桑黄是一种可食用的药用真菌，可作为药物和膳食补充剂。

研究证明，桑黄具有多种药理作用，包括抗炎、抗肿瘤和抗氧化。此外，它还具有调节肠道菌群的能力。然而，桑黄对于IBD的治疗潜力尚未被探索。本研究旨在确定桑黄多酚（SH）的抗结肠炎作用，并探讨其有益作用是否与肠道菌群密切相关，以及潜在的肠道分子机制。

本研究首先评估了SH抗结肠炎活性，并通过一种涉及体内功能验证和粪菌移植的综合方法证实了肠道菌群在其抗结肠炎作用中的重要贡献。

此外，本研究还确定了关键的肠道细菌种类及其活性代谢产物5-羟基吲哚-3-乙酸（5HIAA），他们是SH改善结肠炎作用的关键介质，主要通过激活AhR信号通路发挥抗结肠炎作用。本研究不仅有助于更深入地了解SH的治疗潜力，而且也为今后探索SH和肠道菌群治疗结肠炎的治疗途径奠定了科学基础。

1.SH减轻DSS诱导的C57BL/6小鼠结肠炎

桑黄在中国已经实现了大规模的人工栽培（图S1A）。SH是桑黄多酚提取物（93.86% ± 2.78%）（图S1B；表S1)。本研究首先评价了SH在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠中的抗结肠炎作用（图1A）。与正常小鼠相比，结肠炎小鼠表现出体重减轻（图S2A)、疾病活动指数增加（DAI）（图1B)、结肠长度缩短（图1C；图S2B)、隐窝和结肠组织结构受损（图1D；图S2C)，以及明显的炎症反应（TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和IL-17α增加，IL-4、IL-10和IL-22降低）（图S3)。低剂量和高剂量SH均可改善结肠炎病理症状，主要表现在增加体重，改善结肠长度和结构损伤（图1B-D；S2）。此外，SH给药以剂量依赖性方式逆转了炎症细胞因子水平的变化（图S3），表明SH具有强大的抗炎作用。

氧化应激和肠黏膜屏障对于维持肠道通透性以抵御毒素、致病菌和其他有害物质至关重要。团队在转录和翻译水平上评估了SH对上皮细胞紧密连接蛋白表达的影响，并检测了氧化应激相关基因的表达。与DSS组相比，SH处理组紧密连接蛋白基因Occludin、Claudin-3和Claudin-4的转录水平明显升高（图S4A），结肠组织中NF-kB、Nox4和Stat3的表达水平明显下调（图S4B）。同时，SH也增强了紧密连接蛋白的蛋白表达水平（图S4C-D），证实了SH对粘膜屏障的正向调控作用。此外，经过SH处理后，杯状细胞的数量也显著增加（图S4E）。以上结果表明，SH可显著改善DSS诱导的小鼠结肠炎症状。

2.肠道菌群在SH抗结肠炎作用中起关键作用

为了评估肠道菌群对SH抗结肠炎作用的贡献，团队进行了16S rRNA基因测序分析，以评估SH治疗对肠道菌群的影响。DSS诱导结肠炎小鼠肠道菌群α-多样性明显低于正常小鼠（p < 0.05）。低剂量和高剂量SH处理均显著增加了α-多样性（p < 0.05，p < 0.01）（图1E）。主坐标分析（PCoA）和层次聚类分析显示，SH处理使肠道菌群向正常对照（NC）偏移（图1F-H）。这些结果表明，SH可以显著调节DSS诱导结肠炎小鼠肠道微生物群落。

为了进一步评估SH调节肠道菌群是否足以产生抗炎作用，团队使用含3% DSS处理小鼠，建立急性结肠炎小鼠模型，并将SH处理小鼠（供体）的粪便菌群移植到DSS诱导的结肠炎小鼠（受体）中（图2A）。由于结肠炎模型小鼠的粪便微生物群对结肠炎没有治疗作用（图S5），团队在随后的分析中没有进一步考虑这一点。与DSS小鼠相比，受体小鼠（DSS + SHfe）在体重、DAI评分、结肠长度和组织学方面均向正常趋势恢复（图2B-E；S6A-B）。粪菌移植还提高了血清IL-10和IL-22水平，降低了血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17α水平（图2F-H），表明其具有显著的抗炎作用。重要的是，SH调节的肠道菌群移植明显恢复了结肠炎小鼠的肠道屏障功能，这反映在Occludin, Claudin-2, Claudin-3和Claudin-4 mRNAs和蛋白水平的上调（图2I；S6C）。因此，来自SH处理小鼠的肠道菌群表现出有效的结肠炎改善作用。

3.SH富集Alistipes onderdonkii改善结肠炎

接下来，团队在属水平上仔细研究了肠道菌群的分类组成，以确定SH抗结肠炎作用的核心细菌。结果显示，与DSS组相比，对照组、SHL组和SHH组中，共有12个菌属表达上调，25个菌属表达下调（图S7A）。与对照组相比，模型组有34个菌属增加，13个属菌降低。低剂量SH处理使得10个菌属上调，4个菌属下调。高剂量SH处理后，20个菌属上调，4个菌属下调（图S7B）。差异表达分析显示，只有Alistipes在DSS组显著减少，而在SH治疗后显著增加（图S7C）。进一步Spearman相关分析表明，3个菌属与DAI评分显著负相关、与结肠长度显著正相关，其中Alistipes相关性最为显著（图S7D）。这些结果表明，SH可以显著调节肠道微生物群落，特异性富集Alistipes。

进一步，团队通过物种特异性定量PCR（qPCR）对粪便Alistipes进行定量，发现Alistipes onderdonkii是SH富集的主要菌种（图S7D-E）。团队获得了3株A. onderdonkii，并评价了它们对DSS诱导的结肠炎影响。结果显示，三个菌株中，两个A. onderdonkii菌株（#1：FDB8和#2：FDFM）可有效预防体重减轻，降低DAI评分，恢复结肠组织损伤，改善炎症状态（图3A-E）。此外，A. onderdonkii提高了紧密连接蛋白的表达，以增强肠道屏障功能（图3F-H）。因此，A. onderdonkii可能是介导SH抗结肠炎作用的关键有效物种。有趣的是， A. onderdonkii（#3）几乎没有改善结肠炎，甚至造成了有害的影响（图S8），表现出了菌株特异性的功能。

4.5-羟基吲哚-3-乙酸（5HIAA）是一种关键活性代谢产物

考虑到SH对肠道菌群的调节作用，团队对粪便样本进行了代谢组学分析，旨在识别功能微生物代谢产物。如图S9A所示，与NC小鼠相比，DSS诱导结肠炎小鼠中代谢物水平发生显著改变（图S9A），而SH处理组的代谢物谱与NC组接近，表明SH显著恢复了微生物代谢物的分布（图S9A）。随后，团队确定5HIAA在SH处理后显著升高（图S9B-C）。通过对3株A. onderdonkii功能基因序列的全面分析，发现2株A. onderdonkii（#1：FDB8和#2：FDFM）的基因组中含有一个与诱导吲哚化合物生物合成相关的tpl基因。相比之下，第三株菌株（#3：FDPA）的基因组缺乏这个特定的基因（图S9D）。为了证明A. onderdonkii确实具有产生5HIAA的能力，团队采用高效液相色谱（HPLC）对A. onderdonkii培养上清液中5HIAA含量进行检测，发现5HIAA浓度高达33.5 μg/mL。

值得注意的是，5HIAA的产生与A. onderdonkii改善结肠炎的作用相关，主要表现为两个有效的A. onderdonkii菌株产生的5HIAA（33.5和16.83 μg/ml）多于无效菌株（0.83μg/ml）（图S9E)。代谢物与结肠炎指数的相关分析显示，有22种代谢物与结肠炎症状密切相关，其中5HIAA与结肠长度呈正相关，与DAI评分呈负相关（图S9F)。因此，SH可以促进5HIAA产生，这可能是与SH抗结肠炎作用相关的关键微生物代谢产物，尤其是A. onderdonkii。

据报道，肠道微生物产生的IAA可以缓解结肠炎。因此，团队研究了与IAA密切相关的衍生物5HIAA对DSS诱导结肠炎的影响（图4A）。IAA治疗显著改善了结肠炎的症状（图4B-F），这与之前的报道结果一致，而5HIAA在缓解结肠炎方面的表现明显优于IAA（图4B-F）。此外，这两种吲哚衍生物都能有效地提高抗炎因子的水平，降低促炎因子的水平，以减轻炎症反应（图S10A-B）。在DSS诱导小鼠中，吲哚衍生物也降低了氧化应激相关基因（NF-kB、Nox4和Stat3）的相对表达（图S10C）。此外，IAA和5HIAA均上调了紧密连接蛋白Occludin和Claudins的表达，后者具有显著性（图S10D-E）。

5.结肠AhR激活对SH抗结肠炎具有重要作用

既往研究表明，微生物来源的吲哚衍生物可以通过结合并激活AhR来保护结肠炎，提示SH可能通过富集Alistipes及其代谢物5HIAA来激活AhR，从而改善结肠炎。为了证实这一假说，团队首先检测了AhR下游基因（Cypa1、Cypa2和Cypb1）在结肠中的表达水平。结果显示，5HIAA和SH两种处理均显著上调了Cypa1、Cypa2和Cypb1（图5A-B）基因水平，表明AhR在结肠组织中被激活。随后，团队用AhR抑制剂处理DSS小鼠，以验证AhR信号通路对SH抗结肠炎疗效的贡献。AhR拮抗剂StemRegenin 1基本上消除了5HIAA对结肠炎的改善作用，如体重、DAI、结肠长度、血清IL-22和IL-10水平，以及结肠组织病理学（图5C-H）。AhR拮抗剂消除了SH治疗对体重的有益作用（图5C-H），但对DAI、结肠长度等指标的消除作用明显减弱（图5C-H）。

通过对Caco-2细胞的体外实验，进一步验证了AhR信号通路的激活情况。CCK-8检测结果显示，五种浓度的5HIAA对Caco-2细胞都没有细胞毒性作用（图S11A）。虽然5-HIAA处理后Caco-2细胞中AhR的表达没有明显变化，但Cypa1、Cypa2和Cypb1的表达明显增加（图S11B），提示5HIAA部分激活了AhR信号通路。以上结果表明，SH至少大部分通过激活AhR信号通路来缓解结肠炎。

IBD构成了一个重大的全球公共卫生挑战。考虑到临床药物的不良反应和高复发率，探索干预和治疗IBD的新策略具有重要意义。令人信服的证据表明，肠道菌群及其代谢物与IBD 的发展之间存在复杂联系。此外，天然药物作为一个巨大的潜在资源库，由于其优异的有效性和安全性，以及对肠道微生物群的积极调节，为治疗IBD提供了有效的候选者。

本研究证实了SH（桑黄多酚）的抗肠炎作用和对肠道菌群的调节作用。简单言之，SH富集的A. onderdonkii促进了微生物代谢物5HIAA的产生，它可以作为一种有效的配体激活AhR信号，从而显著改善DSS诱导的小鼠结肠炎。这种对微生物机制的理解丰富了我们对天然药物和肠道菌群之间相互作用的理解，促进对结肠炎新型治疗药物的开发。

尽管桑黄抗结肠炎作用已在多项研究中被报道，其潜在机制仍有待进一步阐明。值得注意的是，SH对结肠炎的有益作用尚未完全阐明。在本研究中，团队首次提供了强有力的证据，证实了SH具有强大的抗结肠炎疗效。

虽然本研究提供了坚实证据，表明肠道菌群及其代谢物5HIAA在SH的抗结肠炎作用中起着关键作用，但本研究仍存在一些不足之处。在实验中，SH是预防性地给予DSS诱导结肠炎小鼠。SH作为一种复杂提取物，可以隔离DSS，从而防止DSS诱导的结肠炎。因此，今后应评估SH的治疗效果，以消除SH可能通过与DSS直接相互作用来预防结肠炎的可能性。此外，SH还可能通过其他机制，如NF-κB和NLRP3/caspase-1信号通路，从而改善结肠炎。这一推测是基于以下事实：使用AhR拮抗剂处理大大消除了5HIAA对结肠炎的有益作用，但是SH的抗结肠炎疗效仅部分受损，说明5HIAA的富集并不是SH减少结肠炎的唯一途径。

此外，5HIAA是由表达色氨酸酶的肠道微生物组发酵色氨酸产生的吲哚代谢物。这意味着多种细菌可能有产生5HIAA的能力。在这项工作中，团队发现了其中一种细菌A. onderdonkii可以产生5HIAA，这强调了肠道微生物可以通过产生吲哚衍生物，包括5HIAA和IAA，以此来缓解结肠炎。其他产生吲哚及其衍生物的细菌需要在未来的研究中进一步探索。而由于团队尚未进行定植评估、毒理学检测和进一步功能验证等一系列研究，所鉴定的肠道菌株A. onderdonkii是否可以进一步发展为产品尚不清楚。因此，需要进一步研究桑黄抗结肠炎作用及其作用机制，从而促进SH的开发和应用。

本研究成果是李有贵等团队在炎症性肠病（IBD）治疗等方面研究取得的全新进展。研究团队利用齐碳纳米孔测序平台长读长技术优势结合二代测序，完成了桑黄多酚抗结肠炎肠道分子机制的验证和揭示，为开发结肠炎治疗策略提供了可靠的科学理论依据。