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为帮助广大用户及时了解日益丰富多样的酶标仪检测技术,仪器信息网特别盘点了酶标仪主流检测技术,分为上、下两篇,以飨读者。
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本期将为广大用户盘点荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)、时间分辨荧光(TRF)、匀相时间分辨荧光(HTRF)及Alpha检测5种酶标仪检测技术。
5.荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)
1948年,Foster首次提出荧光共振能量转移(FRET)理论,指两个荧光基团间能量通过偶极-偶极耦合作用以非辐射方式从供体(Donor)传递给受体(acceptor)的现象(如图所示)。
FRET原理示意图(图源网络)
想要实现FRET,荧光供体和受体分子必须满足以下几个前提条件:(1)供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱须有一定程度的重叠,一般大于30%(重叠越多,FRET效果越好);(2)供体分子和受体分子间的距离须小于10nm(一般为7~10nm);(3)供体分子和受体分子的共振方向须平行或近似平行。
FRET主流的荧光探针主要有三种:荧光蛋白、传统有机分子和镧系元素。
典型应用:蛋白结构和构象改变、蛋白的空间分布和组装、受体/配体相互作用、核酸结构和构象改变、脂类的分布和转运、膜蛋白的研究、核酸检测等应用。
6.生物发光共振能量转移(Bioluminescence Resonance Energy Transfer,BRET)
生物发光能量共振转移(BRET)检测原理与FRET类似,不同的是供体产生生物发光来激发受体荧光分子,无需激发光,背景更低,也避免了光漂白和自发荧光等问题。
BRET原理示意图(图源网络)
BRET于1999年首次报道,但由于使用荧光素酶导致信号强不足,因此BRET检测的灵敏度和动态范围较低。2015年,Promega公司完成了重大技术升级,将BRET技术带入了一个新的阶段:NanoBRET。与传统BRET检测相比,NanoBRET检测获得的光谱叠加更佳、信号更强且背景更低。
典型应用:活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用。
7.时间分辨荧光(Time-resolved fluorescence,TRF)
时间分辨荧光(TRF)是一种高级荧光检测技术,使用镧系金属做荧光标记(其荧光比普通荧光持续时间更长,普通荧光的半衰期为纳秒级,镧系元素的半衰期是毫秒级。),利用荧光分子之间荧光寿命的差异来分离所需的荧光信号。与传统荧光检测方法相比,TRF具有灵敏度高、样品制备简单、检测重复性好的优点。
常规TRF技术包括荧光寿命成像(Fluorescence Lifetime Imaging,FLIM)技术和时间分辨荧光免疫分析(Time-Resolved Fluoroimmunoassay,TRFIA)技术。其中TRFIA技术是将时间分辨荧光与免疫分析技术相结合,以三价镧系元素离子或其螯合物,例如铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)和镝(Dy)为标记物,来代替常用的荧光物质对抗原抗体进行标记,并使用带有时间分辨荧光检测功能的仪器(如酶标仪)来对荧光强度信号进行检测,最终绘制标准荧光曲线,定量分析待测物的浓度。
TRFIA原理示意图(图源网络)
典型应用:GPCR测定、激酶测定、细胞因子和生物标志物检测、细胞代谢、蛋白质-蛋白质相互作用、受体-配体相互作用、药物发现、高通量筛选等。
8.均相时间分辨荧光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,HTRF)
均相时间分辨荧光(HTRF)是基于TRFIA技术衍生出的新技术,将TRF技术和FRET技术相结合,能量供体选择镧系元素铕(Eu)和铽(Tb)的穴状化合物,交联别藻蓝蛋白(cross-linked APC)或小分子荧光探针d2)作为受体,当供体和受体距离足够近时,供体被一个能量源激发,可以引发能量转移到受体,使其在特定波长发出荧光,用于检测生物分子之间的相互作用。
HTRF原理示意图(图源网络)
检测时,通过延缓检测时间,让短寿命的荧光衰变掉后,再检测荧光强度,消除背景荧光的干扰。同时HTRF技术在均相(溶液)中一步反应,无需包被、封闭、洗涤等繁琐的操作步骤。因此该技术具有背景低、特异性好、操作简单、体系稳定等优点。
典型应用:GPCRs配体结合、细胞水平的蛋白激酶实验、蛋白磷酸化、生物治疗药物研发、蛋白互作、生物因子或者趋化因子等。
9.放大化学发光亲和均相检测(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay Screen,AlphaScreen)
放大化学发光亲和均相检测(AlphaScreen)是基于Ullman在1994年开发的LOCI (Luminescent Oxygen Channeling Assay)技术发展而来。简单来说,AlphaScreen是以微珠为基础的匀相发光能量转移技术。人们习惯性将AlphaScreen技术和AlphaLisa技术统称为ALPHA技术。
AlphaScreen技术需要两个由不同的化学混合物组成的微珠,分别为供体微珠(Donor beads)和受体微珠(Acceptor beads)。其中供体微珠包含了光敏剂苯二甲蓝(Phthalocyanine),在680nm激光的照射下,它周围环境中的氧分子转化成一种高能活跃的氧状态-单体氧(Singlet Oxygen)。单体氧可以在溶液中扩散高达200nm的距离。如果在该范围内存在受体微珠,单体氧就会触发受体微珠的二甲基噻吩衍生物,继而通过激发一系列的化学反应,最终在520-620nm产生光信号,从而达到检测目的。
AlphaScreen原理示意图(图源网络)
区别于AlphaScreen,AlphaLisa受体珠使用铕螯合物作为最终的荧光团,在615nm处以较窄的峰发射光。即AlphaLisa受体珠不太容易受到缓冲成分或其他吸收520-600nm光的化学物质的干扰。
AlphaScreen和AlphaLisa受体珠的发射光谱(图源网络)
典型应用:GPCR 测定、激酶测定、细胞因子定量、生物标志物检测、细胞信号传导、蛋白质-蛋白质相互作用、药物发现、高通量筛选等。
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以上就是荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)、时间分辨荧光(TRF)、匀相时间分辨荧光(HTRF)和Alpha检测5种酶标仪检测技术盘点。希望本篇盘点对您有所帮助,如有技术干货、科研成果、酶标仪仪器使用心得等内容,欢迎相关行业朋友投稿。投稿邮箱:zhaoyw@instrument.com.cn。
参考资料:
1. Fluorescence resonance energy transfer in revealing protein-protein interactions in living cells
2. Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer (BRET)
3. 浅谈时间分辨荧光技术:https://mp.weixin.qq.com/s/GfOrqrOpP2JTjY7DWP2-eQ
4. HTRF Assay Principle:www.cisbio.net/content/htrf-technology-basics
5. The use of AlphaScreen technologyin HTS: current status
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