中科院分子细胞卓越中心高工涂溢晖：光片显微成像技术应用心得及经验分享

生命科学研究过程离不开各类科学仪器的帮助，仪器信息网特别策划话题：“生命科学技术平台经验分享”，邀请高校、科研院所公共技术平台的老师分享技术心得和经验，方便生命科学领域研究人员了解相关技术进展，学习仪器使用方法。本篇由中国科学院分子细胞科学卓越创新中心细胞分析技术平台高级技术主管涂溢晖撰写，涂老师对光片显微镜的成像特点、难点、解决方法以及应用范围进行了详细的阐述。以下为供稿内容：

显微镜自从300多年前发明以来，因其制样相对简单、观察参数多、可活体成像等特点成为生命科学领域不可或缺的研究工具。而近百年来理论和技术的飞速发展，使得显微镜成像的质量、空间分辨率和时间分辨率都有很大的提升。

宽场显微镜光路简单、成像便捷，使用最广泛，但因非焦平面的光干扰而图像信噪比较差。激光共聚焦扫描显微镜加入了共轭的针孔，过滤掉了非焦平面的信号而大大提升图像的信噪比、提高分辨率，但因其是点扫描成像，成像速度大大降低，而且因为物镜工作距离和数值孔径的制约，成像深度一般也只有200微米左右。双光子显微镜因红外激光穿透力的提升，虽然可将成像深度扩展到1毫米，但光毒性和光漂白作用非常大。

要做到在组织细胞水平上大尺度大视野的成像，目前光片显微镜是一个不错的选择。光片显微镜与上述传统显微镜在光路上有很大的区别（图1），传统显微镜激发和发射在同一个方向上，而光片显微镜采用正交光路设计，即从样品侧面照射激发样品荧光，成像物镜与照明物镜成90度正交，互相垂直。样品受激发的层面即成像层面，不存在离焦信号，提高了图像的信噪比，通过移动光束或样品快速获取全样品的荧光信号，减少对样品的光毒性和光漂白。为了保证照明光路的均匀，通常使用两个照明物镜进行双侧照明，采用sCOMS成像，提高量子效率和成像速度。

图1. 宽场显微镜与光片显微镜光路示意图

目前实现光片的技术主要有高斯扫描光束、贝塞尔光束和晶格光束。高斯扫描光束利用扫描振镜的高速运动将点状光束形成“虚拟”片状光源。贝塞尔光束是一种非衍射光束，在一定距离内几乎没有衍射，经过散射后，形变失真很小。相比高斯光束，它能形成更薄的光片。晶格光片可以理解为结构照明的贝塞尔光束，它既保持了光片空间上的薄度，又利用结构照明提高空间分辨率。

生物样品要想做到大尺度、深层次的成像，只有光路上的改进是不够的，生物样品之所以无法做到深度成像，另一个很重要的原因就是生物样品结构多、成分复杂，且任何一个组分都能吸收光和散射光，这就导致激发光和发射光都还无法穿透较厚的样品就被吸收或散射掉了。因此，要想进行深层次的生物样品成像，须将样品进行透明化处理，即用化学试剂将样品中的脂质、水分、色素等物质去除，从而使样品达到透明状态，内部的折射率尽量均一，减少光的吸收和散射。

目前常用的透明化方法有有机溶剂和水溶剂两种方法。有机溶剂透明化方法即疏水透明化方法，一般先用脱水试剂去除水分和一部分脂质，再用有机溶剂去除脂质，最后浸入折射率匹配液中，以获得均匀的折射率。常用的方法有iDISCO和PEGASOS等，以上方法透明化程度高，用时较短，与蛋白质的折射率更匹配，缺点是样品有一定程度的固缩，有机试剂会引起荧光蛋白淬灭或保护性较差，有毒性且会挥发。

水溶试剂透明化方法即亲水透明化方法，一般用除垢剂将样品中的脂质去除，再匹配折射率。常用的方法有CUBIC，该方法对荧光蛋白保护性较好，价格便宜，试剂相对更安全，但用时较长，样品有轻度的膨大。科学家们又利用其膨大样品的特性，筛选出既能保持样品结构又能将其膨大数倍之大的CUBIC-X的方法，将更多细节暴露在显微镜下并得以清晰成像。水凝胶包埋透明化方法，如CLARITY、PACT、SHIELD等方法应用较少，它对荧光蛋白保护性好，但用时较长，需要专用设备。

生物样品的抗体标记一般在透明化之前。常规带荧光的生物样品可以首选水溶性试剂进行透明化处理，结构致密或坚硬的组织用有机溶剂透明化效果可能更好。在成像过程中如果需要用胶水固定样品的话，且样品的体积又很微小，可以用低熔点琼脂糖进行包埋。

对本身较透明的样品或经过透明化的样品，在光片显微镜上可以进行大视野、大尺度、深层次、亚细胞水平的荧光成像，成像广度和深度都可达到厘米级。光片显微镜在神经学、发育学、肿瘤学等生命科学领域都有广泛应用。

光片显微镜虽然能对透明化的整个组织甚至小动物进行细胞水平的整体荧光成像，获取得到很多以前无法获得的图像，但是在实际应用中仍存在一些问题。

首先，因为透明化试剂多种多样，每种的折射率都不一样，所以每次更换成像物镜或换新的透明化试剂，都需要调节光路以匹配相应的折射率，以达到最佳的成像效果。成像用透明化试剂必须干净无杂无气泡。

其次，成像质量仍然受限于成像物镜NA值，要想提高成像分辨率，必须用高NA的物镜，但这样物镜的工作距离和景深就小，会带来成像深度的降低。样品虽然透明或经过了透明化处理，组织样品的荧光强度仍然会随着离成像物镜距离的增加而衰减，从而形成近物镜的样品荧光相对较强，远离物镜的荧光相对较弱。那么在满足目标细胞、结构清晰成像的情况下，可以考虑减少样品的厚度，或是通过双物镜成像或旋转样品多次成像，使成像质量得到提升，但是荧光衰减的现象仍然无法完全避免。

再次，透明化使用的有机试剂的毒性和对物镜的潜在危害需要考虑在内。

最后，就是光片显微镜成像的数据庞大，单个文件从几十GB到TB级，这就给后期的运算处理带来很大的挑战。

在今后的应用中，无毒化、渗透迅速、对蛋白保护性好的透明化试剂的开发将可以缩短样品处理等待时间、保护表达的蛋白以及实验人员的健康。对于庞大数据的后期处理算法的改进与优化，将减少数据存储占用空间、缩短实验数据处理时间，提升用户的使用体验感，最终拓展该技术在生命科学领域、临床精准诊断领域等的应用前景。

作者简介

涂溢晖，高级工程师，现任中国科学院分子细胞科学卓越创新中心细胞分析技术平台高级技术主管。2004年加入中科院生物化学和细胞生物学研究所细胞分析技术平台，致力于细胞分析新技术新方法的开发及应用推广、大型仪器运行维护及技术服务的共享和显微成像、流式专业人才的培养，到目前完成了三个中科院功能开发项目。