苏州医工所李辉组流式光片成像系统实现斑马鱼高通量三维成像

结构和功能的异质性是普遍存在的生命现象，这要求在生殖发育研究、药物筛选等领域进行大规模的样品研究来消除个体差异。其中斑马鱼作为一种重要的模式生物，由于其体积小、透明度好、繁殖能力强等特点非常适合利用其进行大规模成像，在大规模遗传发育研究和药物筛选方面具有明显优势。然而目前常规成像技术受进样方式及成像方法限制，往往只能对少数斑马鱼样品进行手动操作的二维成像。近年来发展的光片照明显微镜可以实现对斑马鱼进行高分辨、低光照的三维成像，但是由于凝胶固定等复杂的样品准备流程，仍然无法满高通量的成像需求。并且获得一个完整的斑马鱼胚胎三维图像，往往需要在多个区域中分别扫描成像而后进行图像拼接，进一步限制了其在高通量分析中的应用。

鉴于此，中科院苏州医工所李辉课题组将流式成像与光片结合，建立了流式光片成像系统（light-sheet flow imaging system， LS-FIS）。通过设计精密的控制时序，斑马鱼样品逐个地被加载到与水具有相似折射率的FEP管道中，并以倾斜的角度连续通过光片照明区域，与光片面垂直的物镜采集荧光信号进行成像。LS-FIS在样品流过照明面时进行连续成像，每帧图像叠加形成三维图像，从而实现了不进行图像拼接的情况下全斑马鱼胚胎的高通量三维成像。研究人员还在光片光路中引入明场照明与成像来完成样品运动速度标定与矫正，实现优于3μm的细胞分辨率三维成像。得益于高效的流式进样方式以及先进的图像重建算法，利用LS-FIS可实现200 胚胎/小时的全斑马鱼胚胎三维成像，相较于传统光片技术通量提高了50倍以上，这为使用斑马鱼进行大规模的遗传发育研究和药物筛选提供了仪器装备基础。相关结果以“Heterogeneities of zebrafish vasculature development studied by a high throughput light-sheet flow imaging system”的论文标题发表在最近的Biomedical Optical Express期刊上。

图1 a）LS-FIS系统光路图；（b）LS-FIS液路图；（c）利用LS-FIS获得的典型全胚胎斑马鱼血管三维图像Tg(kdrl: EGFP)；（d）躯干放大图；（e）图b中三维截面图可清晰分辨血管内壁；（f）头部放大视图，可清晰分辨主要血管结构

利用LS-FIS技术，研究人员进行了斑马鱼躯干及头部血管发育研究，统计并分析了3-9 dpf的斑马鱼节间血管三维长度及眼部晶状体血管网形态变化，共获得超过500条全胚胎斑马鱼三维图像。针对这些大量数据的统计分析显示，节间血管总长在7dpf前持续增长，并且与二维结果一致；但7-9dpf间由于形态卷曲程度增加，二维图像已难以正确体现真实的血管长度，体现出三维成像在血管发育定量评价中的重要性。另一方面，针对晶状体血管网络这种典型的三维空间结构，仅二维成像更加无法全面获得其特征信息。而通过LS-FIS，可以方便地从全胚胎三维结构中分割出眼部区域，进而统计其形态结构，研究结果表明，虽然眼部晶状体血管网络（hyaloid basket）的形态在3-8dpf内仍然为持续增长趋势，但其方差仅为节间血管发育的10%。这提示尽管来自同一批胚胎，斑马鱼不同部位的异质性仍然存在很大差距，这也表明了大规模三维成像对于遗传发育的必要性。

图2 （a）全胚胎三维数据中分割出躯干部分节间血管，并绘制血管发育曲线；（b）全胚胎三维数据中分割出头（左上）部及晶状体血管网络（右上、左下），并统计晶状体网络形状的深度及直径信息，绘制其变化曲线（右下）

为适应大规模三维图像数据自动化分析的要求，研究人员还开发了基于深度学习的相关图像分析处理算法。针对斑马鱼节间血管，提出了一种多尺度特征的三维卷积神经网络（MS-3D U-Net），通过多尺度特性学习和基于硬注意力机制的损失函数，实现了对三维图像的血管分割和识别，识别准确度达到90%以上（AUC值）。相关结果也发表在Biomedical Optical Express期刊上[1]。

图3 LS-FIS样机

论文第一作者为助理研究员杨光，通讯作者为李辉研究员。LS-FIS样机和图像分析算法为斑马鱼大规模三维成像，进行异型性研究提供了完整解决方案。本工作得到中国科学院仪器装备研制，国家自然科学基金委等项目的支持。

参考文献：

1. J. Yin, G. Yang, X. Qin, H. Li, and L. Wang, "Optimized U-Net model for 3D light-sheet image segmentation of zebrafish trunk vessels," Biomed. Opt. Express, BOE 13(5), 2896–2908 (2022).