基于流的分析微阵列 ——使用选择性生物探针进行定量和定性测定

迈克尔·塞德尔（Michael Seidel）

• 如果要在一个样品中测定多种分析物，分析微阵列是理想的解决方案。基于流的分析系统的优势在于它们可以在现场以自动化的形式快速、定量地分析样品。

• 近年来，基于流式化学发光 (CL) 微阵列的微阵列芯片读取器 (MCR) 分析平台不断优化，其在各种生物分析应用中的实用性得到了证明。

• GWK Präzisionstechnik 公司以原型开发的形式进一步优化了最新一代设备。该设备提供了使用泵和阀门控制实现全自动测定性能的可能性，并通过集成的高灵敏度 CCD 相机进行后续测量图像采集，非常适合长达 2 分钟的采集时间。由于要建立各种生物分析试验进行研究，该仪器被命名为 MCR-Research (R)（图 1）。

• 在下文中，将简要描述各个微阵列检测类型以及应用程序。

图 1：用于 SARS-CoV-2 抗体检测的基于流式 CL 微阵列的 MCR-R 微阵列分析平台示例。

检测血液中针对 SARS-CoV-2 的抗体

检测针对 SARS-CoV-2 的抗体的问题是在大流行开始时提出的，由巴伐利亚研究基金会资助。重组抗原（SARS-CoV-2 蛋白，包括刺突蛋白 (S1) 和核衣壳 (N) 蛋白以及受体结合结构域 (RBD)）固定在微阵列芯片上。

血液样本中的抗体可以与这些重组抗原结合。然后，带有辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的抗人 IgG 抗体通过泵系统通过流通式微阵列芯片，在随后的步骤中通过添加鲁米诺和过氧化氢来观察结合的抗体。

基于流动的微阵列免疫测定 (MIA) 原理的一个主要优点是使用间接非竞争性 MIA 非常快速和同时测定针对不同抗原的抗体（图 2）。因此，例如，可以将疫苗衍生抗体与 SARS-CoV-2 感染后的抗体区分开来。

图 2：血清和血液中 SARS-CoV-2 抗体的间接非竞争性 MIA 流程图。

此外，可以确定针对不同 SARS-CoV-2 变体的抗体，或者可以通过其他呼吸道病原体扩展抗体组，例如，检测针对流感的抗体。

此外，MCR 的多功能性与相关的流通微阵列芯片和程序选项也提供了建立的可能性，例如，通过竞争性 MIA 对中和抗体进行定量分析。在这里，可以确定哪些抗体实际上可以阻止病原体进入细胞，从而在预防感染方面特别有效。CL-MIA 只需不到 15 分钟，可用于现场分析，例如医疗实践。使用 CL-MIA 和 MCR 检测 SARS-CoV-2 抗体的第一个结果已经发表 [1,2]。

基于抗体的蒸发冷却系统嗜肺军团菌检测和亚型分析

媒体多次报道军团菌爆发，通常可以追溯到蒸发冷却系统。这些系统可以产生含有军团菌的生物气溶胶，这取决于致病菌株，在吸入可吸入的嗜肺军团菌后，会在人体中引发轻度庞蒂亚克热或严重的肺炎，即军团病。

为此，成立了第 42 届 BImSchV，负责规范蒸发冷却系统、冷却塔、湿式分离器的安全技术运行以及冷却水中军团菌的定期控制。如果超过测量值（冷却塔每 100 毫升 50,000 个军团菌，其他需要报告的系统每 100 毫升 10,000 个军团菌），则必须立即采取措施大幅降低病原体浓度。此外，必须进行血清分型。

代替使用凝集试验（血清组 1 和血清组 1-15 之间的区别）对嗜肺军团菌进行常规血清分型，甚至使用大量 ELISA 微量滴定板对嗜肺军团菌血清组 1 进行亚型分型，也可以使用 MCR。根据该申请，原型设备被称为 Legiotyper。此外，在军团病爆发的情况下，尽快确定源头很重要。这也可以通过仪器实现。

一组单克隆抗体固定在流通式微阵列芯片上。样品手动注入系统，然后是全自动 CL-SMIA（图 3）。单克隆抗体对L. pneumophila血清群 1的不同血清和亚群表现出不同的亲和力和选择性。

图 3：CL-SMIA 示意图：(1) 样品注射，(2) L. pneumophila SG1 亚型与特异性捕获抗体的结合，(3) 抗 SG1 检测抗体与已经结合的军团菌的结合，(4 ) CL 反应和图像采集。

细菌与流通式微阵列芯片上的相应单克隆抗体特异性结合。夹心是由对血清组 1 特异的生物素标记的多克隆抗体形成的。加入 CL 试剂后，进行 CL 吸收。通过将单个菌落悬浮在缓冲液中并在大约 30 分钟内使用该仪器执行 CL-SMIA，在培养后的所有情况下都可以进行血清分型和亚型分型。

在由德国联邦经济和技术部资助的 WIPANO 项目 LegioRapid 中，首次建立了用于蒸发冷却系统快速卫生评估的独立培养方法的标准化方法，该方法在测量后定量确定治疗成功率值已超过。除了 qPCR 和与免疫磁分离 (IMS) 相结合的流式细胞术之外，Legiotyper 被用作第三种方法。

定量测量结果通过qPCR和IMS流式细胞仪从100 mL中100军团菌的浓度获得，其中100 mL水样通过聚碳酸酯过滤器（孔径=0.22µm）过滤，洗脱液直接用于定量测定。只有在样本中发现最低浓度为106个细胞/100 mL时，才能使用Legiotyper进行血清或亚型。对于培养样本，这个最低浓度不是问题。

对于不依赖培养的方法，样品体积必须增加到至少 10 L 才能达到至少 10 4的浓缩系数。正在对合适的过滤方法进行研究 [3]。

对于气溶胶中嗜肺军团菌的分析，可以使用相同的 CL-SMIA，但在样品制备方面存在差异。必须首先使用气溶胶收集器对气溶胶进行采样，科里奥利 µ 旋风收集器适用于该收集器。在这里，细菌以液体形式分离，其中可以直接取样和测量。在 AIF 项目 LegioAir 中，首次表明在生物气溶胶中进行血清分型是可能的。

使用 haRPA对军团菌进行分子生物学检测

微阵列芯片阅读器不仅可用于基于抗体的检测，还可用于分子生物学。课题组开发了异质不对称重组酶聚合酶扩增（简称haRPA，图4）[4,5]，可用于军团菌属。通过在 39°C 下加热流通式微阵列芯片在系统上进行检测。对于 haRPA，军团 菌属特异性引物在空间上固定在 DNA 微阵列芯片上。

图 4：可以在 MCR-R 上执行的 haRPA 原理。(1) 带有固定反向引物的 DNA 微阵列，(2) 添加 DNA 提取物后，重组酶打开双链靶 DNA，(3) 聚合酶延伸反向引物直到 (4) 单链结合蛋白分离, (5) 生物素化的正向引物与固定的双链结合，直到 (6) 第二条 DNA 链被聚合酶延伸。(7) 最后，固定化的扩增子通过链霉亲和素-HRP 进行标记，并使用 CL 进行可视化。

等温核酸扩增可扩增基因组 DNA 的靶序列。通过第二个生物素标记的引物，形成的扩增子被标记并用作链霉亲和素-HRP 的锚点，该链霉亲和素-HRP 通过流通式微阵列芯片。最后，与其他测定一样，通过使用集成 CCD 相机记录 CL 反应生成 CL 图像。信号的强度取决于样品中 DNA 的初始量。扩增允许对非常少量的初始 DNA 进行定量。

haRPA 的原理还允许通过将不同的引物固定在微阵列表面上进行多重分析。这样，样品可以在 45 分钟内区分军团 菌。以及对人类最危险的军团菌属嗜肺军团菌，它可以更好地评估潜在的健康风险。

地表水中的藻类毒素的监测

MCR-R 也用于环境监测。AIF-ZIM 项目 MARCA 关注为即将到来的藻华开发早期预警系统。它是基于云的监测系统的重要组成部分，可用于预测藻类大量繁殖和地表水中蓝藻毒素的形成等。

由于水体富营养化和气候变化，被称为藻华的蓝藻大量繁殖变得越来越频繁。在这种现象期间，水变得非常浑浊，水中的蓝藻毒素含量急剧增加。其后果是水生大型植物的退化和对生物体、人类和动物的危害。

为了预测藻华并在早期采取预防措施，正在开发一种预警系统，该系统能够使用 Triton 水传感器系统持续监测可能指示藻华的化学和物理参数。这些是温度、电导率、总溶解固体 (TDS) 和总悬浮固体 (TSS)、浊度、溶解氧、溶解硝酸盐和总硝酸盐。此外，该仪器还监测水中的蓝藻毒素浓度。

这可以通过再生间接竞争 CL-MIA（图 5）实现，并且由系统在 7 分钟内完全自动执行。例如，微囊藻毒素-LR 的检测限为 4.8 µg/L，因此低于 WHO 的 10 µg/L（对于微囊藻毒素）的限值，低于该限值可假设对健康产生不利影响的可能性较低。

图5：再生间接竞争性MIA的示意图：（1）样品（抗原）与一级抗体的孵育，（2）未结合的一级抗体与固定化毒素的结合，（3）检测抗体结合，（4）CL反应和图像采集，以及（5）下一次测量的再生。

细菌亲和过滤用亲和粘结剂的筛选

微阵列芯片阅读器可用于定量或定性检测，以及研究新的亲和性结合物及其对细菌的结合行为。例如，这些是抗菌多肽、酶或抗体。生物素化细菌通过流通微阵列芯片自动进入设备，在该芯片上固定待研究的亲和力粘合剂。随后，链霉亲和素HRP与结合的生物素结合并催化CL反应，这被捕获为图像。

用适当的缓冲液洗脱细菌后，获得第二个CL图像。因此，细菌的结合和洗脱行为可以得到快速而全面的评估。与无标签生物传感器相比，生物素标签可以更精确地跟踪这种反应。这种筛选策略的另一个优点是可以同时固定多个亲和结合物。这为一次测试许多亲和结合物提供了一种快速的方法，也允许细菌、亲和结合剂和洗脱缓冲液之间的组合具有高度的多样性。

总结

这里描述的例子令人印象深刻地展示了MCR-R分析平台在仪器生物分析中的广泛应用。因此，各种高度相关的领域都可以受益于生物分析方法的使用，因此必须在未来继续推动其扩展。

参考文献

[1] Klüpfel, J.; Koros, R.C.; Dehne, K.; Ungerer, M.; Würstle, S.; Mautner, J.; Feuerherd, M.; Protzer, U.; Hayden, O.; Elsner, M.; Seidel, M. Automated, flow-based chemiluminescence microarray immunoassay for the rapid multiplex detection of IgG antibodies to SARS-CoV-2 in human serum and plasma (CoVRapid CL-MIA). Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2021, 413, 5619–5632. https://doi.org/10.1007/s00216-021-03315-6 .

[2] Klüpfel, J; Paßreiter, S.; Weidlein, N.; Knopp, M.; Ungerer, M.; Protzer, U.; Knolle, P.; Hayden, O.; Elsner, M.; Seidel, M. Fully automated chemiluminescence microarray analysis platform for rapid and multiplexed SARS-CoV-2 serodiagnostics. Analytical Chemistry, 2022, 94, 6, 2855-2864. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c04672 .

[3] Wunderlich, A.; Torggler, C.; Elsaesser, D.; Lück, C.; Niessner, R.; Seidel, M. Rapid quantification method for Legionella pneumophila in surface water. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2016, 408(9), 2203-2213. https://doi.org/10.1007/s00216-016-9362-x .

[4] Kunze, A.; Dilcher, M.; Abd El Wahed, A.; Hufert, F.; Niessner, R. and Seidel, M. On-chip isothermal nucleic acid amplification on flow-based chemiluminescence microarray analysis platform for the detection of viruses and bacteria. Analytical Chemistry, 2016, 88, 898-905. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5b03540 .

[5] Kober, C.; Niessner, R.; Seidel, M. Quantification of viable and non-viable Legionella spp. by heterogeneous asymmetric recombinase polymerase amplification (haRPA) on a flow-based chemiluminescence microarray. Biosensors and Bioelectronics, 2018, 100, 49-55. https://doi.org/10.1016/j.bios.2017.08.053 . 

关于作者

Michael Seidel

德国加钦慕尼黑工业大学水化学研究所分析化学和水化学系主任

Michael Seidel在斯图加特大学学习技术生物学，并在图宾根大学获得物理化学博士学位。在Miltenyi Biotec GmbH担任项目负责人后，他在分析化学主席处成立了一个微阵列研究小组，由Reinhard Niessner教授领导。2014年，他以化学发光微阵列为主题，学习分析化学。直到现在，他还是由Martin Elsner教授领导的分析化学和水化学主席“生物分析和微分析系统”小组的负责人。

他的研究兴趣在于建立创新的（生物）分析方法和仪器、生物传感器、分析微阵列、超顺磁性纳米颗粒、浓缩和分离方法，以快速或自动分析药物、毒素、生物标记物、蛋白质、病原菌和病毒，或在水质监测、食品分析或体外诊断领域的抗生素抗性基因。

原文：

Flow-based analytical microarrays

Quantitative and qualitative determinations with selective biological probes

Wiley Analytical Science，2 September 2022

供稿：符  斌