默克全新专利技术平台-高浓度蛋白粘度降低平台(VRP)，助力皮下注射制剂开发

目前大多数治疗性抗体都是以静脉注射的方式进行给药，由于其伴随着病人顺应性差以及高昂的医疗成本等现实问题，使得皮下注射制剂逐渐成为行业关注的热点。相比于静脉注射，皮下注射具有提高病人的依从性，降低医疗成本等优点，而典型的皮下注射需要控制注射体积(一般为1-2ml)，从而需要提高蛋白浓度，而高浓度蛋白伴随着蛋白粘度的急剧增加，是限制皮下注射制剂的重要原因。

在现实工艺开发过程中往往面临着各种难点:

高粘度蛋白溶液超过粘度注射限，带来可注射性挑战

高浓度高粘度蛋白更容易发生聚集，引起蛋白稳定性挑战

高粘度蛋白溶液引起TFF过滤步骤的通量、工艺效率、回收率降低等挑战

默克高浓度蛋白粘度降低平台 

通过发挥辅料组合协同效应，有效降低蛋白粘度，提高蛋白稳定性，实现高浓度制剂皮下注射。

市售制剂配方粘度对蛋白浓度的依赖性

图1. 市售制剂中抗体浓度与粘度的关系

从图1可以看出，随着蛋白浓度的增加，蛋白可能发生分子间相互作用或者分子拥挤，从而引起蛋白粘度的急剧升高，一些蛋白产品在浓度刚刚达到100 mg/mL时，粘度已经很高，甚至超过了粘度注射限(一般皮下注射药液粘度不超过25mPas), 此时通过注射器给药变得十分困难。为了解决这一问题，我们研究了不同的辅料组合，通过加入这些辅料组合来有效降低蛋白粘度，以满足皮下注射的要求。

材料与方法

选择已经在FDA或EMA注册的单克隆抗体产品进行研究。

在本研究中，我们选择pH7.2的抗TNF-α嵌合单克隆抗体(mAbC) 作为模型药物，考察不同的辅料及组合对其粘度的降低效果。

其中所有辅料和缓冲试剂产品均购自德国默克公司。

采用装有Ultracell-30k超滤膜的Amicon®Ultra-4超滤管进行缓冲液置换和蛋白浓缩。对于辅料研究，以2000 x g的离心力进行离心并置换了5个透析体积，同时用2000 x g离心力进行浓缩。根据Lambert-Beer定律并使用BioSpectrometer® Kinetic (Eppendorf, Hamburg, Germany) 在280 nm处测量来确定蛋白浓度。用相应的缓冲液配制稀释液，使用同样的方法再次验证上述测得结果。

粘度测试：将蛋白样品在20°C平衡后，用m-VROC™粘度计在1000 - 3000s-1的剪切速率下测量蛋白粘度。将200 μL的蛋白样品装入500 μL气密注射器中(Hamilton, Reno, USA)，重复测量3次。

通过Dynapro PRIII (Wyatt Technology, Santa Barbara, USA)的动态光散射(DLS)测量粒子的扩散系数Dt，样品在25°C下采集10次，每次采集5秒。

通过对mAb C在3 ~ 14 mg/mL的浓度范围内的扩散进行线性拟合，得到扩散方程Dt = D0 (1+ kD*C)，并外推得到了无限稀释下的蛋白扩散系数D0。通过绘制Dt/D0的归一化图谱从而确定扩散相互作用指数kD。

通过以下公式计算注射器的推注力:

结果

图2. 单一辅料与辅料组合对mAbC粘度的影响

图2A(单一辅料): 加入75 mM的辅料后，可以观察到蛋白粘度有轻微的降低，但降粘效果不够明显，依然不能满足皮下给药的要求（<25 mPas）。即使提高辅料浓度至原来的两倍，其粘度仍然过高。结果表明，单一辅料无法有效降低mAbC蛋白粘度。

图2B(辅料组合):粉红柱和黄柱分别代表将阳离子辅料和阴离子辅料分别单独添加至蛋白制剂后测定的粘度。蓝柱代表加入辅料组合的理论粘度值。紫柱代表加入辅料组合后实际测试的粘度值。结果表明，通过辅料组合的协同效应能够有效降低mAbC蛋白粘度。

调整辅料组合配比，提高降粘效果

图3为mAbC归一化的扩散系数Dt/D0与蛋白浓度之间的关系图。斜率为0时表示蛋白没有相互作用，斜率的负值越小表明蛋白相互作用越弱。加入不同比例的E1和E5辅料组合后，斜率的负值明显减小，提示蛋白粘度降低。当两种辅料的比例为2:1时，降粘效果最为显著。

图3. Dt/D0与蛋白浓度的关系

辅料组合发挥降粘协同效应

图4结果显示，将几种不同的辅料及其组合分别加入mAbD制剂中，可以观察到几种特定的辅料组合实际粘度值明显低于其理论累加值，说明辅料组合具有协同降粘作用。

图4. 辅料组合对mAbD溶液粘度的影响

粘度降低可显著提高注射性能

图5. 粘度降低对注射力的影响

mAbC：当使用27G针注射原始配方的150mg/mL mAbC制剂时，所需注射力为90N，约9公斤——即一个一岁小女孩的重量；添加行标BM和E3的辅料组合后，所需注射力降为35N，约3-4公斤——一只家猫的重量

mAbD：当使用27G针注射原始配方的150mg/mL mAbD制剂时，所需注射力为140N，约14公斤——一只小袋鼠的重量。添加E1和E4的辅料组合后，所需注射力降为18N，约2公斤——一个蛋糕的重量

辅料组合提高蛋白稳定性

I: 强降解实验设计

采用自身稳定性差的mAb C作为模型药物，进行强降解实验。将150 mM的单一辅料与包含75mM阳离子和75mM阴离子的辅料组合分别添加至80 mg/mL的mAbC制剂溶液中，置于40 °C，75%相对湿度的环境下，在第0天，第14天，第28天分别取样，通过SEC-HPLC测定单体含量。

II: 强降解实验结果

图6. 强降解实验后蛋白溶液外观

（左图为添加单一辅料，右图为添加辅料组合）

图6结果显示，在强降解条件下，使用辅料组合的蛋白溶液澄清度明显优于单一辅料，表明辅料组合应用能够有效提高蛋白稳定性。

图7.SEC-HPLC检测强降解实验后的单体比例

（左图为添加辅料组合，右图为添加单一辅料）

图7左结果表明，经过28天的强降解实验后，使用了辅料组合的制剂与原始制剂配方有相似的单体含量，即降粘辅料组合对制剂的稳定性无负面影响。

图7右结果表明，使用单一辅料E1对单抗mAb C的稳定性没有负面影响，但辅料E4和E5单独使用时，会降低抗体的稳定性，从而降低单体含量。

默克高浓度蛋白粘度

降低平台优势(VRP)

助力皮下注射制剂开发，提高可注射性，病人顺应性

IP专利保护技术平台

Emprove® Expert 辅料支持高风险应用，Emprove® dossiers文档支持，快速响应法规要求

强化下游工艺，提高过滤通量，过滤效率，回收率，从而提高整个过滤工艺经济性

辅料组合发挥协同效应，显著提高粘度下降水平并且保持蛋白粘度与稳定性之间的平衡

市面上实现高剂量皮下注射的不同策略综合对比

1.默克VRP平台展现出制剂开发更简单，成本更低，上市速度更快等优势。

2.默克VRP平台对比酶，辅助设备，可缩短1-3年开发时间，节省30-50%开发成本，加快药物商业化上市步伐。