naica®数字PCR系统助力霍乱弧菌复制关键基因定量检测并验证猜想

导读

霍乱弧菌是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高，属于国际检疫传染病。了解霍乱弧菌的复制原理能够帮助人们更系统的探索其感染机制。

法国巴斯德研究所及华沙大学细菌遗传学系的科学家们在国际知名杂志Nucleic Acids Research上发表了一篇学术论文，揭示了霍乱弧菌的复制机制。（IF=16.971）

应用亮点：

▶  揭示了霍乱弧菌的两条染色体的复制协调机制。

▶ 通过naica®微滴芯片式数字PCR系统对霍乱弧菌复制的关键调控基因进行定量检测并验证猜想。

▶  该研究发现的霍乱弧菌复制机制可能存在于所有弧菌科物种中，对于其他弧菌复制研究具有参考意义。

研究背景：

霍乱弧菌是引起霍乱的病原菌，它由两条染色体（Chr1、Chr2）以精心编排的顺序进行复制。研究发现只有在Chr1上的crtS 位点复制后才会触发Chr2启动。本研究提供了关于 crtS 如何触发Chr2复制起始的新思路，对Chr1-Chr2复制协调机制进行了深入探讨。

研究成果：

❶、crtS（位于Chr1上，启动子结合位点）和39m位点（位于Chr2上，启动子结合位点）通过与启动子RctB竞争结合影响Chr2的复制，crtS的存在降低了RctB与39m的结合。

▲crtS 能够抵消39m位点的抑制作用。Chr2复制起点 (ori2)和39m 位点的序列比对。RctB结合位点以绿色（iterons，启动子结合位点）和红色（39m）表示。

❷、RctB分为4个结构阈，研究发现其通过相同的DNA结合域与crtS和39m相互作用。进一步研究表明RctB域IV对于ori2（Chr2）起始位点的39m和crtS调节都是不可或缺的，并且RctB域IV的C端对于crtS协调两条染色体的复制至关重要。

基于该调控模型，文章使用naica®微滴芯片式数字PCR系统（Stilla Technologies）对霍乱弧菌中的（ori1 /ori2）和对照大肠杆菌中的（oriC / pORI2）进行定量，同时使用naica®多重数字RT-dPCR (Stilla Technologies) 对来自指数生长培养物 (OD600 0.4) 的霍乱弧菌中的 RctB mRNA 进行了定量并证实了上述猜想的正确性。

▲B、 pORI2 相对于大肠杆菌菌株染色体的拷贝数 (CN)，通过在 rctB 中插入终止密码子构建各种 pORI2缺失表达载体。C、在有和没有染色体 crtS 位点 (+/- crtS)的情况下，大肠杆菌中 pORI2 拷贝数的比率。D、Chr2 在非复制型霍乱弧菌中相对于 Chr1 (ori2/ori1) 的拷贝数。在所有突变体中，crtS位点被敲除，RctB结合位点被插入 Chr1 的 attTn7 插入位点（平均值±标准偏差）。

最后文章解释了霍乱弧菌的复制机制模型：

▲crtS 协调 Chr1 和 Chr2 之间复制的模型。RctB 结合位点以绿色 (iterons)、红色 (39m) 和蓝色 (crtS) 显示。OFF = Chr1：crtS 未被复制。Chr2：与39m位点结合的RctB主要通过红色箭头所示来抑制ori2的复制起始。ON = Chr1：crtS 已复制。RctB与复制的crtS位点的瞬时结合导致与39m位点亲和力降低（蓝色箭头），从而释放ori2。RctB与甲基化iterons的结合导致DNA解旋元件 (DUE) 打开，RctB寡聚化到单链DNA上（绿色箭头）。

期刊介绍：

Nucleic Acids Research (NAR)：1974年创刊，由牛津大学出版社经过同行评审公开出版的科学期刊。期刊主要发布涉及核酸代谢和/或相互作用的核酸和蛋白质的物理，化学，生化和生物学方面的前沿研究结果。最新影响因子16.971。