Nature | 基因编辑工具箱或再添神器——TnpB核酸内切酶

转座在生物体基因重塑过程中具有关键性的作用。IS200/IS605 和 IS607 家族的插入序列（insertion sequences, ISs）是最简单的可移动遗传元素之一，仅包含其转座和调节所需的基因。2021年9月9日，张锋团队在Science杂志上发表了一篇题为 The widespread IS200/605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases 的文章（详见BioArt报道：Science | 张锋团队再发文：源于IS200/605转座子家族的多种核酸酶或可成为基因编辑新工具）【1】，重建了CRISPR-Cas9系统的进化起源，发现了3种高度丰富但功能未知的转座子编码的可编程RNA引导核酸酶：IscB、IsrB和TnpB，并对IscB的蛋白功能进行了详细探究。该研究还发现TnpB可能是CRISPR-Cas9/Cas12核酸酶的祖先，推测TnpB也具备RNA引导的核酸酶活性。

近日，来自立陶宛维尔纽斯大学的Virginijus Siksnys团队（CRISPR开创者之一，通过研究CRISPR-Cas9 生化性质，得出了Cas9酶可以定点切割DNA的结论，特别致敬CRISPR幕后的英雄们——最全的一份CRISPR英雄谱）在Nature杂志上在线发表了题为Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease的研究论文。研究人员通过一系列生化实验证实CRISPR-cas核酸酶的祖先TnpB是可重编程的 RNA 引导的功能性核酸酶。TnpB通过reRNA（right element RNA，长非编码RNA，来源于ISDra2转座子中的RE元件）引导去切割靠近TTGAT转座相关模块（Transposon associated motif, TAM）5’端的DNA，并可以切割人类基因组DNA。

如图1所示，IS200/IS605家族的Deinococcus radiodurans ISDra2中包含tnpA和tnpB基因，以及位于两侧的LE（Left element）和RE（Right element）。在纯化TnpB的过程中，作者发现有许多RNA也被一同纯化。对TnpB结合的RNA进行small RNA测序（sRNA-seq）分析，发现它们大多是长度约为150nt的长非编码RNA，来源于ISDra2中的RE序列，作者将这些RNA称为reRNAs（right element RNA）。reRNA 3’端的16nt来源于IS200/IS605转座子的侧翼DNA序列，其余序列与TnpB基因的3’端和RE序列匹配，说明TnpB可以与转座子3’端来源的reRNA形成RNP复合物。

图1. D. radiodurans ISDra2位点

PAM（protospacer adjacent motif）序列是Cas9或Cas12核酸酶启动DNA切割所必须的，那么TnpB发挥作用可能也需要类似的序列。通过PAM鉴定实验【2】，作者观察到在目标基因5’端上游富集了大量的TTGAT序列，并称之为Transposon Associated Motif (TAM)。体外DNA切割实验证实TnpB具备RNA引导的靶向dsDNA的核酸酶活性。进一步分析发现，将TnpB序列中的RuvC-like活性位点突变后，TnpB失去了切割能力，说明RuvC模块与TnpB的活性相关。研究人员发现实现TnpB的DNA切割功能需要同时满足两个条件：（1）TAM序列；（2）与靶基因匹配的位于reRNA 3’端的序列。随后，作者对切割产物进行了测序分析，结果显示，TnpB采取的是一种交错切割模式，在NTS（non-target strand）的多个位置和 TS (target strand) 的单个位置进行切割，最终产生5’-悬挂端（overhangs）（图2）。

图2. TnpB-reRNA复合物切割双链DNA的实验设计及流程

最后，作者探究了TnpB在细胞内切割目标dsDNA的能力。首先，在E.coli中进行的质粒干扰实验表明TnpB可以在原核生物体内切割dsDNA。紧接着，作者想知道TnpB是否可以应用于切割人类基因组。将编码TnpB和reRNA的工具质粒转染至HEK293T细胞中，72小时后，提取基因组DNA（gDNA）测序分析目标切割位点中的序列插入和删除（insertions and deletions，indels）情况（图3）。实验结果显示，TnpB在两个测试靶点（AGBL1-2和EMX1-1）中引入突变的频率为10%-20%，这与之前报道过的CRISPR-Cas9和Cas12的效率类似【3-7】。进一步分析发现，切割位点引入的删除突变占主导地位，与Cas12切割谱中观察到的现象类似【5,7】。这些结果说明RNA引导的TnpB核酸酶可以切割真核生物的基因组DNA。

图3. 利用TnpB编辑人类基因组

综上所述，该研究从ISDra2系统中鉴定了一个新的具有dsDNA切割功能的核酸酶TnpB，其在原核和真核细胞中均能有效切割dsDNA，具有编辑人类基因组的巨大潜力。在进化树上，虽然TnpB与微型 Cas12f核酸酶的关系最为紧密，但作者认为两者之间依旧存在重大区别：（1）TnpB与Cas12f使用的guide RNA不同；（2）TnpB是单体，仅需要一个reRNA；而Cas12f 核酸酶是二聚体，需要结合一个拷贝的crRNA-tracrRNA duplex；（3）TnpB需要TAM序列，Cas12f需要PAM序列，两种序列截然不同。

原文链接:

https://doi.org/10.1038/s41586-021-04058-1