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12月22日,由仪器信息网主办,我要测网、仪课通联合协办的《气相色谱实战宝典》、《液相色谱实战宝典》读者线上交流会成功举办,共吸引200余位来自企业、检测机构、高校科研院所及政府单位的用户报名参加。
本次线上交流会邀请《气相色谱实战宝典》特邀顾问、北京化工大学教授杜振霞,《气相色谱实战宝典》主编、广东省生物制品与药物研究所主任技师徐明全及鹤壁市农产品质量安全监测检验中心高级农艺师张艳丽;《液相色谱实战宝典》特邀顾问、中国科学院兰州化学物理研究所研究员邱洪灯,《液相色谱实战宝典》主编、徐州市畜禽水产品质量检测中心质量负责人端礼钦,《液相色谱实战宝典》副主编、江苏国测检测技术有限公司技术负责人王韦岗进行答疑,旨在帮助一线用户解决学习或工作中遇到的实际问题。
整场交流会气氛十分热烈,6位专家同时在线答疑,网友们踊跃提问,共收集问题60余个。因篇幅有限,小编特整理部分问答,供大家参考。
《气相色谱实战宝典》答疑集锦
问题一:气相色谱柱怎么判断彻底不能用了?从柱子的物理性状上能看出来吗?我这有根-5的色谱柱,变的很脆,柔韧性差了很多,换柱子的时候,一折就断。
杜振霞答:判断柱子能不能用主要有两个方面。
第一,对于新购买的柱子,要先判断柱效是否达到要求,比如用甲苯按照标准的方法测下柱效。
第二,柱子使用一段时间后,可以观察柱子通过同一分离方法对同种物质的分离效果。如果在同样的升温条件下分离度明显下降,那很可能就是柱校下降了。这种情况下可以尝试把升温程序改缓慢一点,在保证峰形的情况下提高分离度;如果还是分不开,说明柱子不能用了。
关于柱子的物理性状,从颜色上看,新柱子为金黄色,随着使用时间会慢慢老化,变成深色棕色;从弹性上看,硅胶柱本来是柔软的,使用过程中慢慢会变脆,此时安装柱子容易折断。
问题二:标准样品用环己烷和乙酸乙酯1:1溶解,我能用正己烷稀释吗?
杜振霞答:可以用正己烷稀释。一般溶剂选择的前提是,可以很好的溶解标准样品,但是有个问题需要考虑。为什么要加乙酸乙酯?可能是因为标样在纯环己烷里面溶解不是特别好,所以要留心观察一下,用正己烷稀释以后,是否还有不溶的东西。
问题三:杜老师好,请问对于中药实验室的应用,有没有开发出来的液相色谱的解决方案?
杜振霞答:应该有,通常有机酸、氯原酸及生物碱的检测是用液相色谱来做的。因为很多生物碱的挥发性不好,无法通过气相色谱检测,这种情况下可以用液相;液相色谱的检测器包括紫外检测器、蒸发光检测器、示差检测器等,使用液相时要考虑到检测器是否匹配。
问题四:张艳丽老师,请问一下,我们测溶残时,先跑6针对照品,再跑样品,对照品中的残留总是带入到样品中,导致样品超标,这种情况我们应该怎么办?
张艳丽答:可以在对照品后面加一针丙酮,让残留走完再进样品;洗针液用丙酮+乙醇,用丙酮是洗掉针里的残留,乙醇洗可以挥发的快些;在气相色谱仪上设置进样前洗3次针,进样后再洗3次针。
问题五:张老师 农残标品工作液贵中心用什么瓶,怎样保存?
张艳丽答:可以用棕色螺丝口瓶,有20mL与8mL的,在冰箱里冷冻保存。
问题六:张老师,买回的有机氯标液,比如六六六,安培瓶上会有丙酮标记,那稀释标液时用丙酮还是正己烷?
张艳丽答:用正已烷稀释,丙酮与正已烷可以互溶的。如果用丙酮的话,与前处理方法样品最后定容的正已烷不一样,定量时有误差。六六六用ECD检测器来检测,ECD检测器对于氧的响应大,使用时尽量避免进含氧的物质,而丙酮CH3COCH3含有一个氧原子,进样多了对ECD检测器不好。
问题七:用户提问:徐老师您好。GC分析样品时,分流与不分流进样对分析结果准确度有影响吗?哪种方法更好?
徐明全答:一般来说,分流与不分流进样对分析结果的准确度没有影响,应该根据不同的应用情况来选择分流还是不分流。原理上,分流是从进样口注入的样品部分进入色谱分离系统、一部分是分离掉了,那是可以避免柱子过载,即进入的样品量小了,但样品的浓度是没有改变的,而不分流进样则注入的样品全部进入系统。
气相色谱适用于微量、痕量分析。当样品浓度太大的时候,要采用分流进样;当样品量特别少,如进行农残、兴奋剂检测时,需要提高检测的灵敏度,这种情况下就应该采用不分流进样,即全部样品都经过柱子与检测器。因为检测器的响应与样品含量,要有一定的线性关系,只有在线性范围内才能准确定量。因峰高(或峰面积)过大或太小时,定量不准确的,所以要通过分流与不分流进样法来测定。
问题八:徐老师 您好!GC用来测试主成分含量合适吗?峰面积只有200左右会不会偏差很大。有没有什么改善的方法?
徐明全答:GC可以用来测试主成分含量。测试中一般不分主成,还是次要成分,或者杂质,只要考虑能否准确定量就可以了。浓度大的或者纯品,只要能配成合适浓度,就可测定。工作中,经常有取样0.1g(精确到0.0001)配成100mL,在取1mL再定容到10 mL之类的操作,就是制备合适的浓度样品,在测定。从没说过主成分或高浓度就不能测定的。
气相色谱法是微量或者衡量分析方法。我们在检测过程中,要保证样品的浓度与仪器的信号呈线性关系,即处于标准曲线的线性范围内,仪器才能准确定量。 如果有些物质浓度比较高,可以通过样品的制备,将浓度调节到能够准确检测的范围内。药物分析一般笼统地称为有效成分,无主成分之分。
峰面积太小,就是说仪器不够灵敏(这句话不对,峰面积太小,偏差会比较大。排除仪器不够灵敏,仪器方面的原因外,可以增加进样量、加大样品浓度、浓缩样品等方法)。方法有检出限和定量限,定量限应该在标准曲线比较中间的地方,因为标曲比较中间的地方更准确一些,而峰面积太小时可能在标曲偏下的地方,偏差会比较大,线性比较差。
对峰面积小的问题,改善的方法有两个,一是保证仪器的灵敏度;二是提高样品的浓度。这种情况下可以增大峰面积,进一步提升检测准确度。
问题九:徐老师,测锂盐的溶剂残留,用碳酸丙烯酯(250)测双氟磺酰亚胺锂里的碳酸二甲酯(90),用1701的柱子合适不?恒温150,碳酸丙烯酯里有个小峰和碳酸二甲酯的峰分不开,峰高只有10+面积也就是20左右,用面积归一计算,误差很大。
徐明全答: 1. 关于1701柱的问题,是标准推荐的,应该没问题,但不同厂家的柱子有较大差异。1701柱虽然都是二甲基聚硅氧烷柱,但其中有的含4%氰丙基苯基,有的含7%,甚至更多,所以分离功能有差异的,选用不同牌子的柱子,应可分离得更好一些。
2. 按照你的情况,用面积归一计算,误差较大是肯定的。一是面积归一化方法本身局限,因检测器对不同化合物的响应,不完全一样;二是没有完全分开;三是峰高或面积过小,都影响分析准确度。对于峰高或峰面积过小的问题,对定量肯定有影响,一般要求2倍到10倍信噪比。信号太小,肯定误差就大。在排除仪器异常的情况下,这可以调节进入检测器的物质浓度(量)来提高。如改变进样囗的分流比、提高进样量、或浓缩样品再进样等等,方法也不少的。
《液相色谱实战宝典》答疑集锦
问题一:老师,pfp色谱柱能替代C18色谱柱吗?
邱洪灯答:ACE C18-PFP相显示有PFP相的多重保留机制,包括疏水性、π-π相互作用、偶极-偶极、氢键和形状选择性。还具有刚性结构,在一定程度上具有更好的选择性,有时候可以用来代替常规C18色谱柱。
问题二:邱老师,我在做九种色素方法开发的时候,有两个峰分不开,几乎完全重合,老师有没有遇到类似情况,流动相仪器条件什么的,都是按照国标进行的。
邱洪灯答:是不是可以更换不同厂家的色谱柱?如果可以的话,可以考虑更换选择性更高的柱子。
问题三:邱老师,色谱方法开发过程中需要注意什么问题?
邱洪灯答:宝典里有答案,各个实验条件都要考虑到:固定相、流动相(有机溶剂比例、缓冲溶液)、流速、柱温等等一系列……
问题四:邱老师可以分享下手性化合物分离的一些经验技巧吗?
邱洪灯答:还是要选择好手性色谱柱和流动相,正相和反相都可以试试,SFC也是很好的一种分离方法。
问题五:如何根据化合物的特性选择合适的键合相?如何对色谱柱进行维护与保养?
端礼钦答:
关于色谱柱的维护与保养,可参考《液相色谱实战宝典》第94页。未领取的网友可点击文末链接一键领取。
问题六:面积归一法测有关物质中,如何做方法验证?
端礼钦答:参考中国药典9101通则,看你有关物质是做定量还是限度,如果是做定量,就要做专属性、线性、精密度、准确度、范围、定量限等要求;如果是做限度,就只要做专属性、检测限、耐用性。
检验检测实验室所述的方法验证,是在RT/T 214-2017通用要求的4.5.14中,指的是需要识别相应的人员、设施、环境、设备等技术能力能否满足要求,还应通过试验证明结果的准确性和可靠性。具体要求可参考:
GB∕T 27417-2017 合格评定 化学分析方法确认和验证指南
GB∕T32465-2015 化学分析方法验证确认和内部质量控制要求
问题七:端老师,您好!待测物Pka值在液相色谱分析方法开发如何运用,怎么简单快速查Pka值。
端礼钦答:pKa:酸式解离常数Ka的负对数,即 :
pKa越小,酸性越强;反之,酸性越弱。
对于酸性和碱性分析物,其保留因子和流动相pH的关系图为:
酸性条件(低pH值)有利于酸性分析物的保留,而碱性条件有利于碱性分析物的保留。且在pH大于或者小于某个值时,保留因子不随pH的变化而变化,而在这两个阶段中间,保留取决于离子化程度。
文献中缓冲盐的pH和pKa以及分析物的pKa数据很多是在水中测定,但是pH和pKa都会随着有机溶剂的加入而发生改变。一般来说随着有机溶剂的加入,酸的pKa变大,而碱的pKa变小。虽然有这些变化,缓冲液的缓冲能力并不会因为有机溶剂的加入而发生变化。因此在配置缓冲液的时候,强烈建议在加入有机溶剂之前调节pH值至目标值,当加入有溶剂后,溶液pH会发生变化,但是此时无需再调节。另外,为防止混合过程中缓冲盐发生析出,务必将有机相加入水相,而不是将水相加入有机相。
如何快速查Pka值
第一,对于已知化合物,我们可以通过一些数据库进行查询。在这里比较推荐几个开放的数据库,第一个是英国RSC的www.chemspider.com,这是一个通用型的数据库,收录的化合物类型也比较广;第二个是针对于药物分子数据的加拿大数据库www.drugbank.ca,第三个是基于美国国立卫生研究院开放化学数据库的https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/,只要输入目标化合物的CAS号或者英文名,就很可能可以在这几个数据库上查到相关信息。
第二,假如我们没办法在数据库中查到相关信息,我们可以根据一些已知数据进行预测。对于一些典型的化学物,我们应该熟知它们的pKa。最常见的脂肪族羧酸pKa值约为5,比如布洛芬的pKa为5.2;典型的胺类化合物的pKa约为9,比如阿米替林的pKa是9.4。这样在分析一些酸碱性的问题时就可以信手拈来,方便快捷。如果要尽量准确地预测一个新化合物的pKa,这就是一个比较系统的工程,因为一般一个化合物的pKa除了与它的关键基团如羧基、氨基等有关,还和这些基团所连接的其他结构有关,因此最好以结构尽量类似的已知化合物的pKa为基础进行预测。
问题八:示差检测器走样品时基线突然上移,是什么原因啊,其它没影响(参比池肯定冲好了,检测器温度也没有变化),紫外检测器可能是电信号,示差检测器工程师也没遇见过,想请教一下可能原因?
王韦岗答:首先,得区分一下基线上移的形式;如果基线是缓慢的向上漂移,影响的因素可能有流动相、色谱柱、流通池或者参比池、仪器性能(如单向阀、泵的稳定性等)、温度、平衡时间等等;
如果走样品时基线突然上移,不走样品时基线没有异常,可以初步判定基线的上移与样品有关联,这时要考虑溶解样品的溶剂、样品与溶剂的互溶性等。
另外一种形式是基线突然向上或向下阶梯式漂移,这种情况,需要检查一下压力波动是否异常,是否有规律性。如果压力异常,则通常与单向阀或泵有关。
另外,示差检测器的信号输出也是光电转换的过程,电压或检测器的异常也可能产生基线的阶梯式变化。
问题九:示差检测器基线波动大,果糖、葡萄糖、蔗糖、三氯蔗糖,检出限响应几乎就是基线,流动相是同一个瓶子里的乙腈水。
王韦岗答:(1)示差检测器灵敏度低,如果做样时基线波动大,会影响样品的测定,因此,首先需要解决基线波动大的问题。前面一个问题解答中提到,示差检测器受流动相组成的影响很大,因此不适合梯度洗脱,即使是使用单通道进行检测,仪器单向阀或者泵的稳定性同样会影响基线,另外流动相的混合也会导致基线有异常。
(2)果糖、葡萄糖、蔗糖、三氯蔗糖,检出限响应几乎就是基线,首先基线波动大,检出限就会高,因为检出限是与基线噪音相关的;另外,示差检测器受温度和平衡时间影响很大,在解决完基线噪音问题之后,同样是建议做样前可以提前一天打开仪器进行预热,如果仪器没有完全预热稳定,示差检测器可能会出现进样不出峰的情况,这种情况我们也遇到过。
(3)果糖、葡萄糖、蔗糖用示差检测器检测响应值还是可以的,示差检测器虽然也可以用于三氯蔗糖的测定,但是响应值较小,建议有条件的老师可以用蒸发光检测器进行检测。
(4)《液相色谱实战宝典》第二章第五节中介绍了示差检测器以及解决示差检测器基线漂移的方法。
问题十:一种新的化合物需要测纯度时怎样快速合理的找到高效液(紫外检测器)相适用的检测方法。
王韦岗答:《液相色谱实战宝典》里第五章中也较为详细的介绍了液相色谱方法开发的步骤和注意事项,大家可以关注一下。这里我就简单的给大家介绍一下方法:首先,得了解新的化合物的性质或者结构,看该化合物是否适合用液相色谱进行分析,如果要用到紫外检测器,还需要看该物质是否具有紫外吸收,没有紫外吸收,肯定不能用紫外检测器进行检测了;如果确定新的化合物具有紫外吸收,能用液相色谱方法进行测定,下一步就是建立高效液相色谱的分析方法,这时候我们可以去查阅一下标准、药典以及期刊论文,如果能在文献中找到合适的方法,则会事半功倍,直接重复别人的方法,能够节约许多方法开发的时间;如果没有相同的物质,可以尝试寻找一些结构类似物质的高效液相色谱分析方法,如果上述方法都行不通,只能从最基础的开始,从新化合物的性质开始分析,然后选择合适的流动相、色谱柱、甚至是更换检测器。
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