细胞分离/提取仪
摘要
北京大学人民医院胸外科杨帆团队和清华大学医学院生物医学工程系郭永团队合作,在《OncoTargets and Therapy》发表题为"Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of de novo EGFR T790M Mutation in Patients with Non-Small Cell Lung Cancer"的研究论文,该研究使用新羿TD-1数字PCR平台,验证了非小细胞肺癌病人中原发EGFR T790M突变与共存的致敏EGFR突变在等位基因上的顺反式关系(顺式排列指两个位点在同一条DNA分子上,反式排列则是指两个位点不在同一条DNA分子上,这两种不同排列方式导致患者对药物的敏感性不一样),并探索了福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本对检测原发EGFR T790M突变的影响。
方法与结果
该研究入组了300例中国非小细胞肺癌患者,所有病人都未使用过EGFR-TKIs。对于前250例患者(A组),通过外科手术获取肿瘤组织后快速冷冻后保存于-80℃;对于后50例患者(B组),获取病人的肿瘤组织和癌旁正常组织,并分别制作成冰冻肿瘤组织、FFPE肿瘤组织、冰冻正常组织和FFPE正常组织。对A组的250例冰冻肿瘤组织进行EGFR基因突变检测,并对同时检出T790M突变和致敏EGFR突变的样本进行等位基因顺反式检测。对B组的4种类型样本进行EGFR基因突变检测,分析4种类型样本中T790M突变比例。(详细流程见图1)
300例冰冻组织EGFR检测结果如下表:
图1 研究设计流程
对3例为L858R+T790M双阳性样本。进一步构建了L858R+T790M双重检测体系,用总RNA分析L858R和T790M的顺反式关系,结果表明,这3例样本均为顺式关系,即L858R和T790M突变存在于同一条DNA分子上(图2)。
图2(A)显示了野生型EGFR的NSCLC细胞系的FAM非特异性信号。(B、C、D)3例NSCLC患者,同时伴有原发T790M和L858R突变,用ddPCR方法检测两种突变的等位基因关系,B、C、D所示为EGFR的原发T790M(FAM标记)和L858R(VIC标记)的双阳性信号, FAM和VIC阴性信号以黑色表示。野生型EGFR L858R和野生型T790M突变的信号以蓝色表示。EGFR L858R突变阳性的信号以绿色表示。原发T790M伴随顺式L858R突变的双阳性信号以橙表示。
对B组的50例病人的4种类型样本进行19Del、L858R和T790M检测,发现T790M在癌旁正常组织FFPE样本的丰度为0.1%-0.5%,而同样的冰冻组织的突变丰度均低于0.1%。这提示在用FFPE样本检测T790M突变时,需仔细确认判读的cut off。
图3 FFPE肿瘤组织样本和FFPE癌旁正常组织样本中的原发T790M突变丰度
研究结论
1、中国NSCLC原发T790M突变发生率很低,在本研究中只有1.3%。
2、本研究发现的3例L858R+T790M双阳性样本为顺式突变,数字PCR可以有效检出。
3、福尔马林固定造成的人工突变会影响FFPE样本的T790M突变检测。所以使用ddPCR检测FFPE样本前,应仔细验证ddPCR检测体系的分析cut off值。
作者介绍
北京大学人民医院胸外科王迅主治医生为该论文的第一作者,北京大学人民医院胸外科杨帆教授与清华大学医学院郭永教授为论文的合作通讯作者。原文链接:
https://www.researchsquare.com/article/rs-29659/v1
[来源:新羿生物(TargetingOne)]
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