新羿数字PCR平台助力mRNA疫苗工艺质控

Aldosari et al., (2021). Lipid Nanoparticles as Delivery Systems for RNA-Based Vaccines. Pharmaceutics, https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13020206.

在mRNA疫苗技术快速发展的同时，关于指导mRNA质量非专有方面的监管指南和行业标准也在不断发展。mRNA疫苗研发和生产中宿主细胞DNA残留和mRNA质量监测至关重要，需要使用敏感且能够精准定量的检测方法为疫苗安全生产把关。

美国药典（USP）于2022年2月23日发布了题为“mRNA疫苗质量分析方法”的指南草案，草案中推荐了纯化mRNA原料药的鉴别、含量、物理状态（完整性）、纯度和安全性的质量评估方法，便于考察mRNA原料药相关的质量属性。USP中指出可以使用数字PCR（dPCR）对mRNA进行定量，无需标准曲线。dPCR平台的检测步骤为先将mRNA反转录为cDNA，将反应体系分割为多个反应单元后进行PCR扩增，PCR反应结束后采集各个反应单元的荧光信号进行分析，从而实现对单份样本中核酸物质的定量检测。定量过程中不需要标准品即可绝对定量，实现单份样品更高的检测灵敏度，使定量分析达到一个全新的水平。

表1.mRNA原料的质量属性-USP

新羿生物的4×RT-dPCR mix 试剂盒以mRNA为模板，搭配新羿自主研发的数字PCR平台，同时完成逆转录和扩增步骤，可以高效、特异、灵敏地定量检测mRNA靶分子。探针涵盖多种mRNA靶序列，也可以用于检测基因表达水平的微小变化。

mRNA原液生产工艺一般分为两个阶段，即DNA转录模板的制备和mRNA的制备。DNA转录模板是通过构建靶标基因DNA序列的克隆质粒，然后将质粒转化至宿主菌中进行扩繁，再抽提获得大量的携带靶标DNA序列的质粒进行酶切获得。在质粒DNA抽提过程中残留的宿主细胞DNA会显著影响体外转录反应和转录mRNA的质量。其他生物制品中宿主细胞DNA残留也会存在一定的风险，如病毒性疫苗中宿主细胞残留DNA相关的风险主要是感染性和致癌性，如果存在逆转录病毒前病毒，其基因会整合入受者基因组可能导致感染；如果存在病毒或传代细胞基质中的致癌基因，则可能具有引发肿瘤的潜在风险。综上所述必须对残留的DNA进行监测，以确保DNA模板的纯度和安全性。

建立合适的宿主残留DNA的检测方法对监测生物制品的安全性和质量可控性至关重要。近几年，国内外各类监管机构出台了生物制品中可接受的宿主细胞残留DNA水平的指导方针。我国《药典》第三部对生物制品的相关规定也指出，应对半成品中残留外源性DNA含量进行检测，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。各国药典也陆续提供了数种检测宿主细胞残留DNA的经典方法，包括阈值法、杂交法及实时定量PCR，但是传统的检测方法存在有弊端。目前，基于实时荧光定量PCR(qPCR)的方法被广泛应用于宿主细胞残留DNA的定量，但是qPCR的检测结果与真实的残留DNA含量有很大差异性，检测重复性不好，并且qPCR定量依赖于标准品，只能进行相对定量，已渐渐不能满足产品生产与质量控制的要求。区别于qPCR对扩增循环数进行相对定量的方法，dPCR技术是根据泊松分布原理及阴性、阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度，dPCR可以实现绝对定量，具有更高的灵敏度、重复性和准确性。

新羿的Probe dPCR SuperMix结合数字PCR平台对宿主细胞DNA残留进行精准定量，实验操作简便、数据分析容易、结果明了，具有广泛应用前景的方法。Probe dPCR Multiplex Supermix在通用试剂基础上进行优化升级，可大幅度提升多重数字PCR的性能，4x浓缩液可加入更大样本量，提高灵敏度，增加微滴群区分度，减少体系优化步骤。Probe dPCR Faster Supermix搭载快速PCR程序进行高效的数字PCR检测，可缩短变性及退火延伸时间、提高变温速率，30-60分钟内完成微液滴式的扩增反应，提升单位时间内的样本检测通量。

● 无需标准曲线的绝对定量  ( DNA / mRNA / miRNA / LncRNA ）

● 提高对抑制物的耐受程度  (克服抑制物对定量结果的干扰）

● 更高的检测灵敏度  (提升高丰度野生型背景下的<0.1%突变检出率）

● 更高的数据精确性  (能识别1.1倍以内的浓度变化）

● 更好的数据重复性  (对靶标核酸含量的连续监测、横向比较）

新羿微滴式数字PCR系统在PCR扩增前把常规的PCR的反应体系微滴化，形成数万个纳升级的油包水微滴，这种微滴化的处理，使得每个微滴中的背景DNA或抑制剂能有效的降低，从而提高了扩增的特异性及检测的灵敏度。新羿生物作为国内数字PCR领域的领先者，拥有数字PCR平台从仪器到耗材、试剂的研发和生产能力。