2020诺贝尔化学奖背后的“神器”—盘点基因编辑的秘密

Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna共同获得2020年诺贝尔化学奖，以表彰他们“for the development of a method for genome editing.”（开发出一种基因组编辑方法）。

关于将化学颁发给研究生物技术的科学家，有些人可能会感到奇怪。笔者开始也是这样认为，经过查阅资料发现诺贝尔奖没有设立“基础医学或者生物学奖”，所以可能就将化学奖给了研究“基因编辑”技术的二位美女科学家。

CRISPR/cas 9的“基因编辑”步骤

图片中的文章就是获奖者当时在Nature的文章

Bacterial strains

准备菌株

文中使用了SLT Spectra Reader的酶标仪，在620 nm的条件下检查培养物生长的状态。

Bacterial transformation

细菌转化

这一步用到了基因导入仪（细胞融合仪），广泛应用于各种动物、植物细胞和微生物的电穿孔，也可作细胞杂交、融合、基因导入的研究。为了提高基因受体细胞导入率及存活率，在真核细胞(如小鼠细胞和人类细胞等哺乳动物)导入基因时，须加入特殊的电缓冲液，在做大肠杆菌等原核细胞和酵母时可以不用以上特殊缓冲液。

DNA manipulations

DNA处理

DNA操作包括：DNA制备（DNA preparation）、扩增（amplification）、酶切（digestion）、连接（ligation）、纯化（purification）、琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）和Southern blot分析。

质粒中插入定点突变试剂盒：QuickChangeR II XL kit (Stratagene).

质粒制备和DNA纯化：Kits (Peqlab Biotechnology GmbH and Qiagen)

In-frame gene deletion in S. pyogenes

化脓性链球菌的框内基因缺失

Construction of plasmids for complementation studies in S. pyogenes

化脓性链球菌互补研究质粒的构建

Construction of plasmids for transformation studies in S. pyogenes

化脓性链球菌转化研究质粒的构建

以上2步使用

RNA preparation

RNA制备

TRI试剂是由Chomczynski开发，是一步法提取分离总RNA的试剂。该试剂RNA分离方法已被广泛应用，是一种对人、动物、植物、酵母、细菌和病毒来源样本进行总RNA或RNA、DNA和蛋白同时分离的一种理想的快速、经济和高效的方法。

cDNA library for differential RNA sequencing (dRNA-seq) and 454 pyrosequencing
cDNA文库的差异RNA测序(dRNA-seq)和454焦磷酸测序

GS FLX系统概括：“一个片段 = 一个磁珠 = 一条读长”。

具体步骤：1）样品输入并片段化；2）文库制备；3）一个DNA片段=一个磁珠；4）乳液PCR扩增。

Northern blot analysis

Northern印迹分析

northern研究的是RNA，southern研究的是DNA，western研究的是蛋白。电泳之后将样品转移到Hybond-N+ or Hybond-XL membranes（两种膜上）。用人工合成的核酸作为探针，检测样品里目的核酸或者目的蛋白的有无和多少。

RNA metabolic stability analysis

RNA代谢稳定性分析

RT-PCR analysis

逆转录聚合酶链反应分析

QIAGEN一步RT-PCR试剂盒提供了Sensiscript和Omniscript逆转录酶、HotStarTaq DNA聚合酶、QIAGEN一步RT-PCR缓冲液、dNTP混合物和Q-Solution（一种新型添加剂，可有效扩增“困难”模板）。单管设置和优化的组件可以获得高灵敏度和成功的结果。

RNA mapping

RNA作图

Mapping可以把原始的fastq格式的数据mapping到参考基因组上，从而获得此reads的位置信息。其中mapping quality代表了reads所mapping的位置是否可信。如果一条reads可以mapping到多个位置，那么就会有比较低的mapping quality。

Mapping会用到多种软件，是一种生物信息学的方法。

miRNA 测序技术的mapping结果的可视

基因组mapping有以下误差来源：

准确度：基因组很大，并且有重复。如果比对错误，则会造成假阳性的误差。敏感性：有variation的序列和参考基因组是不一样的。如果可以高效的把这些序列mapping到参考基因组上，并且每个个体是和参考基因组有差异的，那么实验结果就是比较理想的。速度：二代测序会产生非常多的数据，需要这些序列快速的比对到参考基因组上。

In vitro transcription, purification and 5′ end labeling of RNA

体外RNA的转录、纯化和5'端标记

In vitro RNA structure mapping and footprinting

体外RNA结构定位和足迹

使用了荧光及磷光分析仪（文中提到的型号为，FLA-3000 Series, Fuji富士）。

该仪器的原理：用磷光屏代替X胶片成像的一种自显影仪器。由镧系元素掺杂的特殊晶体制成的磷光屏及信号读出设备组成。样品发射的射线在磷光屏中形成潜影，照射结束后用激光扫描磷光屏，读出其中的潜影信号并转化为数字信号储存。

图片中的注释提到了利用荧光成像仪和图像测量软件测定各泳道二聚体带中RNA的比例。

Computational analysis of DNA and protein sequences

DNA和蛋白质序列的计算分析

文中的计算分析软件：

上面提到的Invitrogen是一家生物信息学领域榜上有名的企业。网页的封面中显示了“Accelerating Research in Life Science”就是最好的证明。

Computational predictions of RNA structure and co-folding

RNA结构和共折叠的计算预测

文中使用的软件为TBI（https://www.tbi.univie.ac.at/）开发的VIENNIA 工具。该软件可以对RNA的结构和折叠进行精准的计算和预测。

Charpentier在2011年发表了这篇文章。后来，与Jennifer Doudna开始了合作共同研究。Doudna是一位对RNA有丰富的认识和经验丰富的生物化学家。他们成功地在试管中对细菌进行了基因的编辑，并简化了基因剪刀的分子组成。

Charpentier和Doudna对基因编辑技术进行重新实验研究，发现了在自然形态下可以从病毒中识别出DNA的方法。这种技术可以在预定的位置切割任何DNA分子，DNA被切割后则生命的密码就容易被改写。

2012年发现CRISPR/Cas9基因剪刀以来，促成了基础研究中的许多重要发现。比如植物学家可以培育出耐霉、害虫和干旱的作物。在医学方面，新的癌症疗法将给遗传疾病的治愈带来希望。基因编辑技术犹如一支神笔，改变生物的遗传密码的同时，也给我们的生活带来了多彩。