HPV检测| 需要使用的科学仪器

2020年5月18日，中国HPV疫苗的一个里程碑。第一针国产疫苗成功在一名10岁小姑娘身上完成注射。疫苗的质量控制情况在上一篇文章里面已经做了介绍（详情戳下图链接），这篇短文带您了解下HPV病毒的检测可以用到哪些科学仪器。【部分仪器未取得中华人民共和国医疗器械注册证，不可用于临床诊断或治疗等相关用途】

宫颈癌的诊断需要检查HPV感染情况。那么，HPV检测最常用的方法呢？又会用到什么生命科学仪器呢？根据现有技术归纳有：染色镜检法(巴氏涂片)、宫颈TCT检查(薄层液基染色法)、DNA检测法和血清学检测。

　　1. TCT液基薄层细胞检测Thin-prep Cytologic Test

　　液基薄层细胞检测系统可以对宫颈细胞进行细胞学分类并诊断受否有病变。该方法是目前国际上最先进的宫颈癌细胞学检查技术，与传统的宫颈刮片(巴氏涂片)检查相比精确度高，对宫颈癌细胞的检出率为100%。对于部分癌前病变，霉菌、滴虫、病毒、衣原体等微生物感染也能识别。

　　细胞保存液：可快速裂解宫颈液样品中的红细胞，效力较强。还含有固定细胞成分，能快速对白细胞和脱落上皮细胞等需要检验的细胞固定，防止细胞自溶。处理后的细胞形态完好，保持采集时的原始形态，防止膨胀、固缩。

　　染色机和液基薄层细胞制片机：经过固定保存的细胞继续通过专用的仪器进行染色和制片，可以制作变成标本。

　　显微成像分析：宫颈液处理好制成标本后，通过高分辩显微成像采集高质量图像，与计算机软件结合，可以检测宫颈糜烂、宫颈癌、宫颈息肉、慢性宫颈炎、宫颈囊肿等相关病变。宫颈癌的早期诊断的金标准。

　　TCT薄层细胞检测要求仪器可以拍摄高清晰度(平场消色差/复消色差)、色彩逼真(24位真彩)、可高倍放大(有效倍数20,000–35,000倍)、智能变焦的画面。并且配备可以得到TBS分类的MDO病理细胞图文报告的计算机软件。随着适龄(25–45岁)女性二级预防措施的意识不断加强，导致医院等检验机构对试剂盒和相关仪器的需求量增大。所以高品质、集成化的仪器与试剂盒将是产业发展的方向。

　　2.HPV-DNA检测

　　临床上HPV-DNA检测的方法主要有：实时荧光聚合酶链反应法(PCR)、基因芯片法和杂交捕获法(HC-II)。下图总结了三种分子生物学方法的特点。下面文章重点介绍了其中需要的一些仪器：

王巧燕, 陈伟华. 国内HPV DNA检测的常见方法比较[J]. 检验医学, 2012(01):77-80.

　　（1）实时荧光定量PCR仪 Quantitative Real-time PCR

　　实时荧光定量PCR仪可以在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

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　　(图为BIO-RAD CFX384 Touch 实时荧光定量 PCR 仪)

　　荧光物质：荧光探针和荧光染料。

　　TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针。探针两端分别标记报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，荧光监测系统可接收到报告荧光基团和淬灭荧光基团分离信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

　　SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

　　分子信标：该探针在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。

　　（2）核酸分子杂交仪 Hybridization Oven

　　杂交捕获法HC-II需要使用分子杂交仪，又叫分子杂交炉或分子杂交箱。核酸分子杂交技术可以检测待测基因组中是否含有已知基因序列。该设备可替代塑料杂交袋和水浴摇床，避免杂交袋破损带来的污染危险。拥有温控精确，空气循环装置独特，升温速度快等特点。广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。分子生物学领和临床诊断中均有应用。

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　　(图为TAITEC HB-100型杂交炉)

　　1)普通分子杂交仪：一般为封闭恒温箱式结构，加上振荡或旋转式可动结构。可实现温度、转速等实验参数的控制和调整。

　　2)半自动分子杂交仪：在人工干预下杂交后可以进行孵育、显色。

　　3)全自动分子杂交仪：主要应用于基因芯片产品，自动化、无需人工参与。基因组DNA与芯片上特异的DNA探针在特定温度条件下反应，杂交、洗膜、孵育、显色等步骤后最终得到检测结果，整个过程全自动完成。

　　（3）核酸提取仪 Nucleic Acid Extraction System

　　核酸提取仪是应用配套的核酸提取试剂来自动完成样本核酸提取工作的仪器。在疾病控制中心、临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测和分子生物学研究等领域广泛应用。自动液体工作站功能非常强大，分液、吸液可自动完成。有些设备还具有扩增、检测的功能，实现提取到检测的全自动化。

　　1)离心柱法：离心柱法核酸提取仪主要采用离心机和自动移液装置相结合的方法，通量一般在1–12个样本。效率和手工提取差不多，价格昂贵，一般不同型号仪器的耗材不能通用，适合经费充足的大型实验室使用。

　　2)磁珠法：以磁珠为载体，利用磁珠在高盐低PH值下磁珠吸附核酸;在低盐高PH值下与核酸分离。移动磁珠和转移液体实现核酸提取纯化，并且可以实现高通量。每次可提取8–96个样本，操作简单快捷，提取96个样本仅需30–45 min。成本低廉，是目前市场上的主流仪器。

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　　(图为TIANGEN TGuide S96自动核酸提取仪)

　　　（4）基因芯片 Genechip

　　基因芯片又称DNA微阵列、生物芯片，其测序原理是杂交测序法。在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针，进行核酸杂交的方法。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，据此可重组出靶核酸的序列。

　　可分为三种主要类型：

　　1)固定在聚合物基片：如尼龙膜，硝酸纤维膜等表面上的核酸探针或cDNA片段。通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。优点为所需检测与技术相对比较成熟。缺点探针密度不高，样品和试剂需求量大，定量检测困难。

　　2)固定在玻璃板DNA探针阵列：通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。点阵密度较大的提高，探针在表面上的结合量也比较一致，标准化生产较难。

　　3)硬质表面直接合成的寡核苷酸探针阵列：与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，探针密度大大提高，试剂用量减少，可以规模化、产业化。

此外，随着技术的进步，现在可以应用数字pcr进行高通量检测。对于HPV病毒的2个致病亚型，可以精准检测。

　　(图为Naica^TM高通量微滴芯片式数字PCR系统)

　　Naica^TM自动化微滴芯片数字PCR系统有3色荧光通道，能够同时检测和定量HPV16和HPV18以及人类参考基因ALB。在每25 μL反应10,000个拷贝的野生型DNA背景下，尽管突变等位基因的频率为0.05%，HPV16和HPV18依然能够精准的被检测到，并且在95%的置信区间内没有检测到假阳性。在连续稀释实验中，3色HPV检测显示预期和测量的HPV16和HPV18浓度之间存在良好的相关性。该数字PCR系统还能够成功地检测口咽癌患者FFPE肿瘤标本DNA中HPV16和HPV18。

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