如何优雅的完成噬菌体的扩增和定量实验？实验汪必备！ | 小奥课堂

开学季又到了实验汪又要去“搬砖”了
如何优雅的搬砖还不用求助师兄师姐

当然是关注“小奥课堂”栏目啦

今天小奥为各位介绍的
是一篇干货满满的 
噬菌体展示方法实践手册 
“噬菌体的扩增与定量”

 这是一份难得的学霸笔记
请收好（收藏）！ 

Part 1

杂交瘤、单细胞克隆和噬菌体展示技术是抗体发现的三种主流技术，其中噬菌体展示技术作为诺奖级别的技术，在生物创新医药研发过程中有着十分重要的作用，极大的加快了抗体类药物研发的进程。噬菌体展示技术不仅在新的抗体和多肽的发现及优化过程中有着核心的作用，还能和传统的动物免疫技术相结合，与纳米抗体、全人源转基因小鼠发现平台进行有效对接，能够广泛用于抗体、抗体偶联药物和CAR-T/TCR-T等领域。本文将针对噬菌体展示技术的噬菌体增殖和扩增实验细节进行探讨、分享具体实验过程的经验，以其原理为根本来指导实验过程，以精益求精的实验过程，增加噬菌体展示技术在抗体发现过程中的成功率。

Part 2 

——噬菌体文库 
 扩增及展示的基本原理 | 

现在普遍应用的噬菌体展示抗体片段的体系称之为“3+3体系”（3为噬菌体的p3衣壳蛋白）；3+3代表着p3衣壳蛋白有两个来源：

• 噬菌粒（phagemid）

• M13KO7辅助噬菌体(Helper Phage）

菌粒（phagemid）上的p3蛋白融合了抗体片段的基因，是文库多样性的关键；辅助噬菌体(Helper Phage)上的p3蛋白为噬菌体天然的p3蛋白。
*噬菌粒是一种比较小的质粒载体，在大肠杆菌感受态中有较高的转化效率，并且能够在大肠杆菌中扩增。

含有噬菌粒的大肠杆菌被辅助噬菌体(Helper Phage)感染后，会利用大肠杆菌的酶系统、原料和能量进行扩增,最终包含噬菌粒的噬菌体从大肠杆菌释放出来，该子代噬菌体的p3衣壳蛋白会展示抗体片段。

Part 3

 ——在噬菌体扩增过程中 
 遇到的难题和对应的解决方案 | 

噬菌体的建库过程实际上是抗体片段基因多样性的传递过程：
从血样中抗体基因的多样性传递到噬菌粒的过程，是噬菌粒文库构建的内容；
从噬菌粒的多样性传递到含有噬菌粒的大肠杆菌的多样性，是噬菌粒质粒电转大肠杆菌的内容；
从含有噬菌粒的大肠杆菌的多样性传递到噬菌体的多样性则是噬菌体扩增的内容，也是本文实验经验关注的问题。

噬菌体的扩增最终目的是将噬菌粒中单一拷贝的抗体片段基因通过噬菌体的扩增过程变成10-100个拷贝，且这些拷贝基因能够在噬菌体表面的p3蛋白上展示出抗体蛋白片段。

在噬菌体的扩增过程要使得文库的多样性得以保持和传递，需根据文库的初始大小确定在扩增过程中含有噬菌粒的大肠杆菌的数目和体积，对应加入的辅助噬菌体的多少进行有效感染，以及扩增后加入多少含有噬菌粒的噬菌体进行淘选等需要一一计算评估的问题，不同文库大小的噬菌体库在扩增过程中需要的扩增体积是不一样的。一份固化的实验方案很有可能会导致文库多样性的丢失。
要弄清楚这些问题，首先要具备以下几点基础的前置知识：

（??以下内容全部划重点！！！）

1. TG1大肠杆菌在OD600的读数：1OD代表的菌浓度为1e9个/ml。
2. 噬菌体/辅助噬菌体在TG1处于对数生长期时有比较好的感染效率，TG1处于对数生长期的OD600值在0.4-0.8。
3. TG1在对数生长期的生长速度是20分钟一代，需要密切关注TG1的生长，及时取菌进行实验。4. 辅助噬菌体和TG1的比值MOI在20：1时能够保证所有TG1被感染上。
5. 含有噬菌粒的噬菌体能够感染正常的TG1大肠杆菌，并将噬菌粒留在TG1中并随着TG1的扩增进行扩增，在无辅助噬菌体的情况下无噬菌体的扩增。
6. 噬菌粒质粒含有青霉素抗性，辅助噬菌体含有卡那霉素抗性。
7. 含有噬菌粒的噬菌体可以通过感染正常的TG1，梯度稀释涂青霉素抗性的琼脂板进行滴度测定。8. 3+3模式下含有噬菌粒的噬菌体展示出p3融合抗体片段蛋白的效率比较低，只有5%-10%,在进行淘选时，加入的噬菌体的滴度应是文库多样性的100倍以上。
还有一个比较关键的问题是噬菌体作为一种病毒，很容易以气溶胶的形式扩散到空气中污染实验室的环境，从而感染F因子阳性的大肠杆菌。 （心疼一下生物汪，冒着生命危险搬砖啊！）
在噬菌体展示的相关实验需要在相对封闭的实验室进行以避免噬菌体对于大肠杆菌的污染，特别是在培养正常的TG1大肠杆菌时。噬菌体的灭活方式通常是紫外照射半小时以上。
（合格的生物汪，是个莫得感情的病毒杀手！）

Part 4 

——噬菌体扩增和定量 
 具体实验过程的分享 | 

以下是以一个文库大小为1E9的噬菌体文库进行扩增的实验方案。
*如果文库过大或者过小，可依比例增减扩增体积。
 

Day 1
（搬砖秃头的第一天）

1. 取含有噬菌粒的TG1菌种1ml (菌数目为1E10)加入含有100ml 2xYT-GA培养基250ml摇瓶中，使用奥豪斯摇床37度220rpm摇菌摇床至OD600为约0.5。2. 取OD600为约0.5的菌液20ml (菌数目为1E10),按照MOI为20：1加入pfu为2E11的辅助噬菌体M13 K07，37度220rpm振荡半小时进行感染。3. 取感染后菌液到50ml离心管使用奥豪斯离心机5816R 3200g离心10分钟，去除培养基，以除去培养基中的葡萄糖对噬菌粒中p3蛋白融合了抗体片段蛋白表达的抑制。4. 用2xYT-AK培养基重悬菌团，将培养基加至400ml，用1L摇瓶在30度220rpm过夜摇菌。

Day 2
（搬砖秃头的第二天）

5. 将400ml菌液均分至大的离心瓶中，使用奥豪斯离心机5816R 10000g离心10分钟，取上清，10000g再次离心10分钟，去除残留的菌体碎片。

6. 取90ml PEG溶液加入400ml上清液中，在4℃孵育1小时并伴随着柔和的振荡，然后使用带低温控制功能的奥豪斯离心机5816R 4℃10000g离心1小时。

7. 去上清，用10mlPBS重悬噬菌体后，加入2.5ml PEG溶液再次沉淀.

8. 冰上孵育20分钟，然后使用带低温控制功能的奥豪斯离心机5816R 4℃ 10000g离心半小时。

9. 去上清液，用吸水纸吸干残留的PEG溶液，加入1-2ml的PBS重悬噬菌体，进行滴度测定。

滴度测定：
1. 在分隔的实验室，取正常的TG1大肠杆菌加入2xYT的培养基中，使用奥豪斯摇床摇菌至OD600值为0.5，如未能及时使用，可放入4℃ 2小时以备用。
2. 将步骤9中扩增噬菌体原液用PBS稀释1E5-1E7倍。
3. 取10ul噬菌体稀释液加入490ul OD600为0.5的TG1大肠杆菌中，使用奥豪斯摇床 37℃ 220rpm振荡半小时进行感染。
4. 取感染液50ul均匀涂抹在含有2xYT-GA的琼脂板中，晾干后放入37℃培养箱过夜。并将未感染TG1大肠杆菌涂抹琼脂板作为阴性对照。
 

Day 3
（搬砖秃头的第三天）

5. 数2xYT-GA的琼脂板中的克隆数，根据稀释倍数计算扩增噬菌体的滴度
噬菌体滴度(pfu/ml)=（克隆数*10*50/10ul）*稀释倍数
6. 取1E11-1E12的噬菌体用于淘选。

试剂配方：
2xYT培养基：Yeast Extract 10.0 g/L+Tryptone 16.0 g/L+NaCl 5.0 g/L
2xYT-GA培养基: 2xYT培养基+100 μg/ml 青霉素+ 1% （W/V）葡萄糖
2xYT-AK培养基：2xYT培养基+100 μg/ml 青霉素+50 μg/ml卡那霉素
PEG溶液：20% (w/v) PEG 6000, 2.5 M NaCl
 

Part 5
仪器推荐：

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此外，噬菌体展示实验的过程中会有不同体积、不同转速和需要4℃条件的离心步骤，如果以多
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