微滴生成不落窠臼 国产数字PCR技术迈进一步——访中科院微生物所杜文斌研究员

　　数字PCR(dPCR)具有比传统qPCR更加出色的灵敏度、特异性和精确度。数字PCR技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面表现出的优势已被普遍认可。数字PCR技术在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、NGS测序文库精确定量和结果验证等诸多方面具有广阔的应用前景。

　　目前数字PCR市场规模仅占到荧光PCR仪的1/10，且主流产品多为欧美跨国公司的高端仪器，在科研和临床的应用还比较初步。令人欣喜的是，经过中国学者的不懈努力，我国已经在数字PCR技术研发上迈出了一大步。

　　杜文斌研究员于2007年在美国芝加哥大学从事博士后工作，开始数字PCR技术相关研究。2011年，杜文斌回国，任中国人民大学化学系特聘研究员。2013年，杜文斌加入中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室，同年入选中组部“青年千人计划”。2014年，杜文斌带领的中科院微生物所研究团队研发出振动微滴制备技术，并基于此技术独立研制了一套独特的数字PCR系统。2016年，由他主持的国家重点研发计划“数字诊疗装备研发”专项项目“新一代高通量数字PCR关键技术及应用研究”启动。

杜文斌 研究员

　　仪器信息网日前对杜文斌研究员进行了专访，通过与杜文斌研究员交流，以及对其实验室的观摩，我们对振动微滴数字PCR技术进行了详细了解。

　　在精准医疗的大趋势下，核酸检测越演越热。杜文斌团队开展的关于数字PCR的工作主要是针对分子诊断领域。

　　“和传统的影像学、免疫学相比，分子诊断能够在发病早期，即在分子水平突变的情况下检测到疾病标志物，使诊断的窗口期前移，提高治疗的有效性，提高生存率”，杜文斌研究员在谈到分子诊断时说道，“另外分子诊断在类似病毒载量监测和产前筛查都有比较好的应用。”

　　数字PCR因为灵敏度高、绝对定量、适合于医院操作等优点，在分子诊断应用方向具有显著优势。

　　“蜻蜓点水”般的振动微滴制备技术

　　加样样品一端连着探针，探针自动吸取样品，孔板上方振动生成液滴，孔板底部是一个加热平台，可以进行加热扩增，扩增完成在机器内进行多通道荧光成像，直接得到检测结果。“从最初将样品放入仪器，到最后直接得到图像结果，整个流程只需要3个小时”。杜文斌研究员向我们介绍道。

杜文斌团队自主研发的全自动振动微滴数字PCR一代样机

　　振动微滴技术是一种液滴形成方式，与目前市场上主流数字PCR仪器厂商微滴形成技术截然不同：其核心是一个特制的加样探针，探针可吸取微升体积的样品，并在特制的孔板上，通过泵出液体时的连续振动，生成均一大小的纳升体积液滴阵列。“这个过程类似于蜻蜓点水”，杜文斌研究员形象地介绍说。

振动微滴制备技术原理及数字PCR扩增效果

　　平台高度集成化 成本降低上百倍

　　与同类数字PCR产品相比，杜文斌团队自主研发的全自动数字PCR样机具有以下特点：

　　1. 平台高度集成化：微滴式数字PCR过程通常包括微滴生成、微滴反应以及微滴检测三个过程。市售微滴式数字PCR仪通常是将三个过程拆分，一个数字PCR平台包含2台或者3台仪器。杜文斌团队研发的数字PCR平台将三个过程高度集成，只需要一台仪器即可完成自动化操作。

　　2. 耗材成本低：杜文斌团队研发的数字PCR仪没有芯片等高昂的耗材费用，唯一的耗材为具有自主知识产权的特制塑料针管。

　　3. 结果准确度高：杜文斌团队用自主研发的数字PCR装置与qPCR以及市售某主流型号数字PCR仪进行了对照试验，“结果表明我们的技术和qPCR试验结果是很相近的，和市售某主流型号数字PCR仪结果对比，也具有非常好的一致性”。

　　据杜文斌研究员介绍，振动微滴PCR技术与目前市场上主流数字PCR仪器技术截然不同，他们自2014年以来已对振动微滴技术申请了专利，未来很可能产业化并进军国际市场。

　　致力微流控高通量微生物研究技术平台开发

　　杜文斌团队多年来从事微流控研究，除数字PCR技术研究外，其团队的研究工作还包括单细胞测序、临床病原微生物快速鉴定和药敏筛查等。

　　杜文斌研究员所在实验室为微生物资源前期开发国家重点实验室，该实验室主要从事微生物资源挖掘、利用、产业转化等工作。仪器信息网编辑走进杜文斌团队所在实验室，发现视野所及之处均整齐的摆满了实验仪器或者仪器配件。

杜文斌研究员为仪器信息网编辑讲解振动微滴数字PCR技术

　　杜文斌研究员带领我们参观他的实验室的同时，向我们介绍了他和团队的主要工作方向，“我们团队一方面，为其他团队提供高通量的微流控分离筛选平台，使微生物资源挖掘和菌株改造、进化能够更加高效；另一方面，也做利用微流控芯片进行分子诊断的工作，如疾病快速诊断和生物安全检测方面研究。”

　　“与传统研究方法相比，利用微流控实现微生物学研究具有诸多优势，”杜老师向我们讲解说，“首先，传统方法虽技术成熟，但是操作繁琐。利用微流控技术，能够实现复杂重复性操作的自动化。其次是传统方法对微生物研究为群落水平，利用微流控技术，能够进行单细胞水平分析。利用微流控技术还能对单细胞的微环境进行控制，从而实现比较精确的群落异质性研究，实现复杂群落的解析。”

　　总体来说，杜文斌团队致力于利用微流控技术解决传统微生物研究中样品复杂、微生物种类繁多、丰度差异性大、微生物类型(细菌、真菌、病毒)多的问题。通过微流控技术，不仅能够实现单细胞培养和生理状态的研究，也能实现单细胞的分选、测序。此外，“微流控技术还能进行分子诊断，尤其是针对临床微生物的快速诊断。”

　　作为中科院微生物所的科研团队，杜文斌老师表示希望能够建立一个比较完整的平台体系用于微生物资源挖掘与鉴定。“通过开发基于微流控技术的快速高通量平台来实现微生物样品分离、微生物培养、高通量分选、菌种进化选育。”杜文斌表明了团队下一步工作计划，“希望我们开发的技术平台不仅能在微生物国家重点实验室应用，也能推广开来，供广大科研单位使用”。

　　后记

　　1999年数字PCR的概念正式被提出，2006年第一台商用数字PCR仪出现，到现在数字PCR市场百花齐放，国产数字PCR技术发展蒸蒸日上。采访中，杜文斌研究员解释说，发展数字PCR技术有很多切入点，单就微液滴生成的方式都有很多可能。技术上超越现有成熟数字PCR技术厂商是很难的，但是大胆创新、另辟蹊径，就一定能在这一细分领域占领一席之地。

　　主要参考文献

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