布鲁克质谱成像之技术-历程-成就-贡献

　　质谱成像是一种前沿质谱技术，由于其技术的新颖性与应用的广泛性，近期受到了很高关注。该技术应用潜力巨大，它是将质谱检测与影像技术相结合的新型分子影像研究手段。特点是无需标记、所需时间短、耗费低、不局限于单分子，同时还可以提供组织切片中多化合物空间分布和分子结构信息。

    作为质谱领域最具前景的技术之一，质谱成像技术现已经成为仪器厂商、科研院所的重要关注焦点，预测未来市场争夺也将日益激烈。布鲁克公司在MALDI质谱成像技术方面坚持创新与发展，拥有当今业内公认的速度最快、通量最高通和性能最全面的rapifleX MALDI-TOF质谱仪。为提升用户对质谱成像技术、应用的了解，促进质谱成像技术的推广应用，仪器信息网特别邀请布鲁克公司对其质谱成像技术、应用等方面进行了讲解。

　　1、请介绍一下贵公司的质谱成像仪器研发过程，这些仪器有哪些特点?

　　一九九七年，美国范德堡大学(Vanderbilt University)的Richard M. Caprioli教授在Analytical Chemistry上发表了题为“Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS” 的文章(Anal. Chem. 1997; 69:4751–4760)，首次提出了MALDI质谱成像技术。在随后的20年间，质谱成像技术迅速发展起来。二零零六年，Caprioli教授在Proteomics上，提出了全新的质谱成像策略：即基于超快速MALDI-TOF质谱和超高分辨MALDI FT-ICR质谱的新一代(next-generation)质谱成像技术(Proteomics 2016, 16, 1678–1689)。

　　布鲁克MALDI质谱成像主要基于两大类质谱：MALDI-TOF以及MALDI FTICR质谱(图1)。

图1 布鲁克MALDI质谱成像系列

　　布鲁克公司自1992年推出第一台商用的MALDI-TOF质谱仪开始，至今已走过25年的历程。布鲁克MALDI-TOF质谱的升级换代过程，成就了MALDI质谱成像技术的创新与发展。目前有autoflex，ultrafleX以及rapifleX三款MALDI-TOF质谱满足成像需求，特别是全新推出的rapifleX(TOF-2015年，TOF/TOF-2016年)，是专门为质谱成像打造的当今业内公认的速度最快、通量最高通和性能最全面的MALDI-TOF质谱仪。

　　新一代质谱成像MALDI-TOF质谱仪rapifleX在技术方面有诸多突破：

　　1)配备全新的smartbeam 3D激光器，激光频率达到业内领先的10 kHz，大大提高了成像数据采集的速度;激光寿命也提高至1010次；

　　2)独特的Beam scanning 技术，能够充分扫描像素点内所有离子，首次实现了真正的方形像素技术，达到像素点全覆盖，显著提高成像质量；

　　3)M5多路数据采集与聚焦技术：超快速覆盖像素面积，提高成像数据采集效率，进一步缩短成像数据采集时间。

　　整合以上技术特点，rapifleX的质谱成像速度从目前业内主流的2-3 pixels/s 飞跃至 20-30 pixels/s，最高可达50 pixels/s。超快速的质谱成像系统，使全面观察复杂的生物样本成为可能，特别是是异质性高，结构多样，面积大的临床样本，优势尤为明显。图2是一个囊肿性纤维化患者肺部组织切片的质谱成像结果。空间分辨率为20 µm，共采集了超过1百万张谱图。超高速的rapifleX质谱，仅6h就完成了数据采集。而用当前主流的其它质谱设备，需要多达4-5 天时间。

图2 全球第一张百万像素的质谱成像图片(空间分辨率 20 µm)。应用超快的 rapiflex质谱，仅需要6个小时;而传统技术需要长达4.5 天。

　　样品为囊肿性纤维化患者肺部组织切片，高亮显示了四种脂类分子在组织上的特异性空间分布。其中m/z 814.5 (蓝色)遍布组织各处， m/z 885.6 (白色)分布与炎症区域，以及充满粘液的气道管腔;而m/z 861.6 (黄色)以及m/z 797.7 (紫色)主要分布于肺实质。(Proteomics 2016, 16, 1678–1689)

　　布鲁克saloriX系列的FT-ICR(傅里叶变换-离子回旋共振)质谱，以超高的分辨率和精准的质量准确度，在成像领域，特别是小分子成像领域表现更为优异。如图3所示，质量差别为0.013 mDa的两个分子，在组织上的分布迥异，这依赖于仪器极高的分辨率；同时，极佳的质量准确度，可以在成像的同时直接定性，获得重要的分子式信息。

图3 FT-ICR质谱成像技术精细显示小分子化合物的空间分布并定性。

2、目前，贵公司质谱成像仪器主要应用在哪些方面?应用情况如何?请举例说明。

　　新药研发是FT-ICR质谱成像的一个重要应用领域。药物研发过程中，仅知道药物最终聚集于哪些组织(例如肝，肾等)是远远不够的，因为质谱成像技术发现药物分子在组织的分布并不均一(图4左)；而用传统的组织病理染色方法(图4右)，无法获得此类信息(chemical& engineering news, 2017, 95(23), 30-34)。在药物毒理学研究方面，传统的做法是将组织匀浆后，获得总体的浓度。然而，这种总浓度的可靠性有待商榷，因为匀浆后的组织中，药物总浓度偏低并不能反映组织局部区域浓度偏高的事实。例如，制药业巨头葛兰素史克(下文简称GSK)发现某种药物的代谢物(绿色)特异性的聚集于小鼠眼球的黑色素层(图5左上)。因此该药物被确定为off-target药物，其研发过程也被终止。

图4 质谱成像(左)显示出药物在肾组织的不均一分布;而传统染色方法(右)无法检测到。

图5 质谱成像(左上)结果显示药物聚集于眼切片黑色素区。成像结果与染色结果叠加确定组织分层信息(右上)。药物在整个眼组织切片上的分布。(下)

　　GSK应用该技术，成功发现了多起药物脱靶(off-target)的案例，极大减少了经济损失。另一个研发实例发生在研究某种肿瘤药物能否用于儿童的治疗(J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2015) 26:887-898)的过程中：MALDI imaging结果发现，在较年幼的大鼠体内，该药物会导致肾脏内磷酸钙的沉淀。而研究表明，由于幼鼠发育不成熟，该药物不能像常规途径一样被肝脏完全代谢掉。在肾内的大量沉淀最终对肾组织造成了较严重的破坏。这项研究成果为研究儿科用药安全性提供了新的指导方向。

　　在药物组织分布的研究领域，一种常用的手段是定量全身放射自显影技术(quantitative whole-body autoradiography, QWBA)。这是一种基于标记的检测手段。由于成本高昂，只能检测最有潜质的有限数目的药物分子;此外，该方法无法区分药物分子本身与其代谢物。在此，质谱成像技术的优势进一步凸显出来：无需标记，一次数据采集可以获取成千上万的不同的分子空间分布信息;药物分子及其代谢物由于分子量的差异也可以完全区分开来。

　　更具有前景的是，质谱成像不仅能靶向的寻找药物及其代谢物的组织分布，还能发现，受药物作用的影响，生物体内内源的其它化合物发生的变化。这也是药物研发科学家孜孜以求的宝贵信息。

　　到目前为止，质谱成像可检测的化合物已经覆盖了小分子(如代谢物，神经递质等)，脂类，多肽，糖类，蛋白等，在神经科学，模式动物的研究，疾病的诊断等领域发挥了巨大作用。近年来，质谱成像技术又创新性的应用于植物组织、细胞以及微生物代谢物的原位检测等。

3、贵公司如何看待质谱成像仪器的技术及市场发展现状?目前有哪些问题亟待解决?

　　对质谱成像的空间分辨率的要求越来越高，除了对仪器硬件提出了新的挑战以外，产生的数据量也急剧膨胀，急需新的信息学，统计分析软件来处理海量数据，以获取有价值的信息。布鲁克公司推出的scils lab软件，具备强大的计算能力，能够处理多个datasets的几百万张谱图;同时软件具有多种统计分析功能，例如主成分分析(PCA和PLSA)，聚类分析(segmentation)，寻找biomarker(ROC曲线)，建立统计模型区分未知样品(classification)等。利用该软件，研究阿尔茨海默症(AD)海马区脂类的变化，共6个正常人和6个AD患者的脑组织样品。计算ROC曲线找到多种差异的脂类信号。(图6，Mendis et al., Brain and Behavior 2016)。

图6 scils软件分析利用ROC曲线计算方法找到多个AD相关的潜在biomarker

　　相比之下，国内的质谱成像研究开始的较晚一些，但是也处在了快速发展阶段。目前 的应用领域也覆盖了临床、方法学、植物、细胞等各个方面。以中科院化学所聂宗秀研究员为例。他开发的多种质谱成像新基质，有效解决了在组织背景下，耐盐性不佳，质谱信号差，基质背景峰多等多种问题，极大的提升了小分子代谢物的成像效率。聂宗秀研究员还开创性的利用碳纳米材料在低质量端的碳离子束信号作为指纹峰，间接的检测碳纳米材料在多种器官中的组织分布(图7)，为研究碳纳米材料作为小分子药物靶向作用的载体奠定了基础(Nat. Nanotech. 2015, 10, 176-182 )。该研究发表在权威期刊Nature Nanotechnology上，得到了学术界很高的评价，还入选该期刊10周年专刊。

图7 1)碳纳米材料在鼠不同组织中的分布；2)碳纳米管在脾组织中主要分布在免疫应答活跃的边缘区。

4、质谱成像仪器需求情况如何?贵公司质谱成像仪器推广做了哪些工作?进一步发展计划如何?

　　布鲁克也在不断的从技术和应用角度推进国内成像技术的发展。仅今年下半年，就先后于8月份在广东工业大学举办了质谱成像的workshop；在11月初，邀请了国内外质谱成像领域的专家，瑞典乌普萨拉大学质谱成像中心的负责人Per E. Andrén教授，中科院化学所的聂宗秀研究员，以及在Caprioli教授实验室工作过多年的布鲁克全球成像市场经理Shannon Connet博士，在中科院大连化物所以及中科院动物所，举办了质谱成像技术高端研讨告。会后的交流也非常踊跃。也激发了更多科研人员对质谱成像研究的兴趣。

图8: 2017年布鲁克质谱成像研讨会 1)中科院动物所 2)中科院大连化物所

　　布鲁克公司对MALDI质谱成像技术的应用前景充满希望，相信创新性的质谱成像技术将会被愈来愈多的科学家和技术人员所了解和应用。我们愿为人类探索生命科学的奥秘提供独具特色的质谱成像技术，同时不断改进和完善MALDI成像整体解决方案。