当细胞遇上拉曼 会碰撞出什么样的火花——访牛津大学副教授黄巍博士

　　现在生物界有一个很重要的研究方向，同时也是目前国际上最前沿的研究领域之一：单细胞生物学，美国能源部、美国科学院以及欧洲科学院都很关注这个领域。据介绍，在过去的两年中，每1到2个星期，重要学术刊物如Nature系列或Science都会有关单细胞技术的文章。而且，在剑桥的Sanger研究所单细胞研究中心就有这样一句标语：“Single cell research is the new frontier of modern cell biology(单细胞研究是细胞生物学的新前沿)”，足见单细胞研究的重要性。

　　细胞是生物体基本的结构和功能单位，此项研究关系着胚胎的发育、癌细胞早期诊断、探索自然环境中占绝大多数的不可培养微生物等各方面的问题。其实在很早就有科学家研究单细胞的检测技术，包括显微镜、流式细胞仪、微流控及各种分离提取技术等，这些技术可以观测到细胞的大小、形态等等，但是这些还不够，其中最关键的问题是基于什么信号来分离和研究细胞，这是科学界需要问的问题，也是仪器界需要关注的问题。

　　大约十多年前，拉曼走入了单细胞研究领域。为什么会将拉曼用于单细胞的检测?目前国内外的研究状况如何?都取得了哪些成果?非常幸运的是，仪器信息网编辑在HORIBA主办的第三届国际拉曼前沿技术高端论坛（RamanFest 2015）上采访到了将拉曼用于单细胞分析的早期开拓者之一，英国牛津大学的副教授黄巍博士。

英国牛津大学副教授 黄巍博士

　　单细胞如何遇到拉曼?

　　黄巍在国外生活了十七年了，主要研究环境微生物和合成生物学，过去十几年中一直利用拉曼光谱进行单细胞的研究工作，同时也开发一些拉曼联用技术，可谓是将拉曼引入单细胞分析中的“领路人”，是什么样的原因促使他将单细胞和拉曼联系在一起呢?

　　黄巍介绍到，“细胞那么多，如何去大海里捞针?有没有一个方法能在这一群细胞里找到有特殊功能或者特殊表型的细胞，将它们分选出来，然后再进行研究，这样效率会更高一些，这也是为什么将拉曼引入单细胞分析的一个重要的原因。”

　　“单细胞拉曼图谱最大的特点就是无需外援标记，展现给大家的是细胞的内在信号，可以视为细胞的化学指纹或者化学画像。”黄巍谈到，所谓的化学画像，是指细胞的表型(phenotype)，是基因和环境互相作用的结果。它不同于基因型(genotype)，基因型是由基因决定的，只是说具有某种潜质，但是不一定表达出来。也就是说，即使细胞的遗传学完全一样，表型也会出现变化，因为基因表达在某种程度上来说是一个随机的过程。

　　“人和人之间可以通过表型例如长相、身材的不同来识别你我他，但是单个细胞在显微镜下很难从形态上看出有什么不同，而我们可以利用拉曼技术得到单个细胞水平的分子画像，进而进行细胞判别。单细胞拉曼图谱可以看作一个细胞所有分子光谱指纹的总和，而细胞任何代谢的变化都会引起细胞表型的变化，因此从理论上讲癌细胞的拉曼图谱应与正常细胞的拉曼图谱不一样，在某种程度上来讲，拉曼也许会检测到这种变化，这在癌症研究，特别是乳腺癌的研究中已经做了很多的工作。我们是想发展这样的一个概念，把单细胞的拉曼图谱看成是单个细胞的表型。”黄巍介绍到。

　　“现在的很多研究都需要预知某个蛋白，然后设计一个抗体，用荧光标记，然后再进行研究。但是很多时候，要预知的本来就是需要解决的问题，比如细胞胚胎发育中哪些分子发生变化了，这个时候就可以用拉曼技术来观察细胞的表型，拉曼起到探索的作用。”

　　“再者，微生物学领域一直有一个重大的挑战，在环境中，包括人体肠道微生物里90%以上的微生物还无法在实验室分纯培养，而这些微生物和人体的代谢以及一些疾病有很多关系，它们作为身体的一部分，影响着整个身体的代谢。由于不能培养，我们很难知道它们的生理功能，当时研究的驱动力就是想怎样避开培养的问题去研究这些细胞的代谢，最终我们选择了拉曼技术，而且我们知道采用稳定同位素技术可以把细胞和代谢直接联系起来，这也更坚定了我们在这方面研究的决心。”

　　“还有一点，现在的很多单细胞研究技术对细胞功能是有干扰的，如果标记上抗体之后，细胞的行为就不是原来天然的行为了，而拉曼可以实现无标记的检测。”

　　拉曼在单细胞检测领域中的三大挑战

　　黄巍在拉曼的单细胞分析领域已经耕耘了十多年，他说，现在高通量的分析方法，如DNA测序技术已经很成熟了，但是在表型方面的技术还比较欠缺，我们希望拉曼能作为检测表型的技术，为单细胞的检测技术贡献一部分信息。此外，他们还希望将拉曼信号作为大数据的一部分，融入到整个单细胞大数据体系中去，据悉，这部分工作在牛津大学才刚刚开始。

　　不过，同时，黄巍也介绍了拉曼在单细胞检测方面面临的三大挑战：

　　首先，拉曼信号的增强。拉曼信号天然很弱，如果采用SERS增强技术就要用金、银等纳米材料等进行修饰，这还在研究和探索过程中，而且现在对SERS的机理研究还不是很透彻，怎样提高检测灵敏度和分辨率，这是最重要的挑战;

　　第二，拉曼单细胞技术和其他技术的整合。在单细胞分析中，利用拉曼技术将细胞分选出来之后要进行单细胞测序或微流控在线培养，如何将分选技术与下游的测序技术、培养技术结合起来是一个挑战;

　　第三，单细胞拉曼信号的解析。单细胞拉曼信号是多分子叠加在一起的结果，甚至还有一些未知的特殊分子、蛋白等，没有标准，怎样分析、理解这些拉曼信号，如何进行数据的提取和处理也是一个很大的挑战。

　　FACS与RACS：互补，非替代

　　我们了解到，黄巍和中科院青岛能源所徐健教授的团队合作开发的“活体单细胞拉曼分选仪”(RACS)在2013年就通过了验收并且有了样机。对于目前的进展情况，黄巍介绍到，之前的样机还处在研究应用阶段，还没有商业化出售，但是作为一个平台已经做了很多样品了。

　　虽然，世界上第一台活体单细胞拉曼分选仪已经问世，但是研究并没有停止，据黄巍介绍，2013年的样机是针对具有光合作用的细胞，有一定的局限性。最近采用了“pause release”和单细胞弹射技术，就可以针对几乎所有的细胞。“具体来说，我们通过控制微流控的流速，停一下，再分选，这样就可以克服拉曼信号天然比较弱的缺点，同时还可以实现自动分选。其中，单细胞拉曼检测和激光弹射分选技术可用于精确分选复杂样品和组织细胞，今年刚刚解决这个问题，预计今年年底之前就可以完成原理的证明等问题，同时也会出一系列的文章。”

　　当笔者问起，目前在单细胞研究领域用的最多的要属流式细胞仪(FACS)，RACS的出现将会给FACS带来哪些挑战?黄巍介绍到，两者之间并非是要相互替代，而是互补的。

　　黄巍介绍到，50年代开发的流式细胞仪，直到现在依然在用。流式细胞仪是基于荧光信号的，而每一个荧光信号都需要一个滤光片，最好的也就是可以同时看几十个信号，而拉曼图谱包括1000多个信号，是一个很复杂的指纹信息，相比FACS，RACS的拓展面要大很多。

　　“不过，两者并非是要谁替代谁，总体来说是互补的，”黄巍介绍到，“虽然表面上看起来FACS比RACS速度快，但是RACS得到是整个细胞表型的图谱，相当于给细胞画像，如果是这样的话就不算慢了。”

　　“此外，2007年，我们和维也纳大学的Michael Wagner教授也发展了Raman FISH(拉曼-荧光原位杂交)技术，可以把荧光和拉曼的技术结合起来。荧光标记某些特定的细胞，可快速识别，作为粗筛，缩小范围之后再用拉曼获取单细胞表型，进行细分。”

　　同时，黄巍也指出，“FACS发展了40多年后才成熟，RACS要做到成熟，还需要一点时间。”

　　拉曼在生命科学“初露头角” 合作是关键

　　据黄巍介绍，目前拉曼在生命科学中的研究目前主要聚焦两个方面的应用：微生物学和医学方面。其中后者的驱动力更大一些，主要体现在两个方面，一个是通过拉曼光谱技术进行癌症的早期诊断，第二个是更加前沿的拉曼辅助手术(Raman aided surgery)技术，即利用拉曼光谱技术帮助医生快速判断潜在的癌细胞，指导医生的手术，德国在这方面的研究比较多，虽然现在还只是处在实验阶段，但在临床上已经勾画了美好的蓝图。

　　但是，作为一项非常前沿的技术，现在拉曼在生命科学中的应用研究才刚刚露出水面，还处在早期阶段，不过，国外已经开始认识到它的重要性，很多课题组已经小有成果。

　　鉴于拉曼的优势，现在学术界普遍看好拉曼在生命科学的应用，很多老师反映，在德国耶拿举办的第24届国际拉曼光谱学大会 (24th ICORS)上，拉曼在生命科学中的研究就已成为一大热点话题。现在，国内的一些课题组也在尝试将拉曼用于生命科学体系的研究中，但是目前还处于初级阶段，有很多问题亟待解决，比如很多做化学的人不了解代谢的机理，亦或做生物的人很难解析拉曼谱图等。

　　对此，黄巍谈到，我个人认为这是一个分两步走的过程，可以先从一个很简单，很清楚的拉曼信号开始，比如我们采用了一个简单的方法，利用重水中的氘稳定同位素探针来判别单细胞总体代谢活性，这个原理很清楚(最新研究成果：Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jan 13;112(2):E194-203.)。

　　此外，对于拉曼谱图解析的问题需要很多人共同来解决，现在很多生物界的人没有拉曼的基础，但是化学家很清楚，也许当一个生物学家碰上一个化学家问题就会迎刃而解了。

　　因此，多学科的交流、合作是非常重要的，化学、分子生物学、遗传学等各学科在一起交流才会有新的突破。

采访编辑：叶建