饲料中三聚氰胺检测的全套解决方案

 饲料中三聚氰胺检测的全套解决方案

续“三鹿奶粉三聚氰胺”事件、“韩伟鸡蛋”事件之后，饲料中三聚氰胺检测又成为人们关注的一大焦点，大连依利特分析仪器有限公司作为国内知名厂家，参照NY/T 1372-2007《饲料中三聚氰胺的测定》，又及时地为您提供饲料中三聚氰胺检测的分析方法及推荐仪器配置在内的全套解决方案。

【样品前处理】
称取饲料样品0.40g(精确到0.01g)，置于10mL具塞刻度试管中，加入7mL 1%三氯乙酸，涡旋混匀，超声提取10min；再加入0.5mL 10%乙酸锌溶液和0.5mL 10%亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀，用1%三氯乙酸定容至满刻度线；样品经10000rpm，离心5min；取5mL上清液作为待净化液。
依次用3mL 甲醇和5mL 水活化SPE柱；将待净化液用水稀释至10mL，转移至固相萃取柱，依次用3mL 水和3mL 甲醇洗涤，抽至近干后，用6mL 5%氨化甲醇溶液洗脱。整个过程控制流速不超过1mL/min。洗脱液50℃下用氮气吹干，残留物用1mL流动相溶解，涡旋混合，过0.45µm 油系滤膜，供HPLC分析。

【仪器与试剂】
UV1201紫外-可见检测器；P1201高压恒流泵；ZWII型色谱柱温箱；Elite MSP色谱柱(5µm，I.D.4.6mm×150mm)；三聚氰胺标准品(>99%)；阳离子交换固相萃取柱(Thermo Retain-CX, 60mg, 3mL)；氢氧化钠、柠檬酸(分析纯)、辛烷磺酸钠(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、乙酸锌(分析纯)、亚铁氰化钾(分析纯)、三氯乙酸(分析纯)、氨水(25%)、超纯水(二次过滤)，各种饲料样品。

【试剂配制】
① 三聚氰胺标准储备液
称取50.0mg(精确到0.1mg)三聚氰胺标准品，用20%甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中，该溶液浓度为1mg/L，于4℃冰箱储存，有效期3个月。
使用时，用流动相将储备液分别稀释到不同浓度即可。标准系列工作曲线包括1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、50mg/mL。

② 1% 三氯乙酸溶液
称取10.0g三氯乙酸，加水定容到1000mL。
③ 10%乙酸锌溶液
称取10.0g乙酸锌，加水定容到100mL。
④ 10%亚铁氰化钾溶液
称取10.0g亚铁氰化钾，加水定容到100mL。
⑤ 氨水甲醇溶液
量取5mL氨水溶液，加入100mL甲醇混合均匀。

【分析方法】
色谱柱：Elite MSP 5µm(ID4.6mm×150mm)
流动相：乙腈/缓冲盐=10/90(缓冲盐——含10mM柠檬酸和10mM辛烷磺酸钠，调节pH至3.0)
流速：1.5mL/min
波长：240nm
室温：控制在22~28℃之间
进样量：20µL

【实验结果】
1. 标准品谱图
10mg/L的三聚氰胺标准品的实验谱图如下： 

图1 10mg/L标准溶液谱图

2. 重现性
采用此方法分析三聚氰胺，连续进样重现性良好。 

图2 5mg/L标准溶液连续进样11次重现性

表1 5mg/L标准溶液连续进样11次重现性数据
编号 保留时间/min 峰面积/mV•sec
1 14.687 207.21
2 14.679 206.85
3 14.665 206.28
4 14.637 205.23
5 14.638 206.12
6 14.616 206.36
7 14.586 207.66
8 14.620 207.55
9 14.627 207.84
10 14.659 207.83
11 14.689 207.71
平均值 14.65 206.97
RSD/% 0.23 0.42

3. 线性相关性测试
如图3、4，在所测试浓度范围内，三聚氰胺标准品具有良好的线性相关性，相关系数均为0.9999。 


图3 不同浓度标准品叠加谱图 


图4 实验的校准曲线


4. 加标回收率
图5对比可知，在标准品出峰位置，样品没有明显出峰，故该样品为阴性样品或三聚氰胺含量低于该系统的方法检出限，用此样品做加标回收率实验，结果见表2。 


图5 未知样品、空白及样品加标叠加谱图

表2 饲料样品的加标回收率结果
加标量(mg/kg) 平行实验一
(mg/kg) 平行实验二
(mg/kg) 平均值
(mg/kg) 回收率%
1.0 1.05 1.03 1.04 104.0%
5.0 4.36 4.51 4.44 88.8%
10.0 9.63 9.25 9.44 94.4%
25.0 21.97 21.77 21.87 87.5%

如表2结果，在4个不同的加标水平下，该方法三聚氰胺的加标回收率在87.5%~104.0%之间，说明方法准确性良好。

5. 检测限、定量限
依据噪声值，按3倍信噪比，计算其理论检出限，按10倍信噪比，计算其理论定量限如下：

计算方法 检出限(mg/kg) 定量限(mg/kg)
校正曲线方法 0.046 0.153

6. 系统稳定性测试
同一饲料加标样品，一分为三，采用所述方法连续处理三次，并测试谱图计算结果，如图6和表3所示。 


图6 样品分析叠加谱图

表3 平行样品测试结果
平行实验一
(mg/kg) 平行实验二
(mg/kg) 平行实验三
(mg/kg) 平均值
(mg/kg) RSD%
4.36 4.51 4.42 4.43 1.47

同一样品，平行测试3次，测试三聚氰胺结果RSD值为1.47%，说明该系统稳定性良好。


7. 实际样品定性和定量结果
采用所述方法，对饲料样品进行了分析，谱图如下，结果如表4。

表4 饲料实际样品测试结果
样品编号 一 二 三 四 五 六 七
三聚氰胺含量(mg/kg) 未检出 未检出 0.63 25.07 770.47 1.41 未检出 


图7 饲料样品一分析谱图 


图8 饲料样品二分析谱图 



图9 饲料样品三分析谱图 


图10 饲料样品四分析谱图 



图11 饲料样品五分析谱图 


图12 饲料样品六分析谱图 



图13 饲料样品七分析谱图


附件1：HyperSep Retain-CX产品介绍
产品名称: HyperSep Retain-CX
填料基质: 磺酸基功能化的聚苯乙烯/二乙烯基苯萃取柱
规格型号:60mg/3mL
产品货号:60107-303
产品图片: 

生产商: Thermo Fisher Scientific
产品特点:
 三聚氰胺前处理
 碱性、非极性分析物的均可保留
 从生物样品中萃取碱性药物的理想选择

附2：饲料中三聚氰胺检测依利特全套配置清单
测试用分析方法包
序号 名称 规格级别 数量 产地
1 柠檬酸 分析纯 50g 国产
2 辛烷磺酸钠 色谱纯 60g 国产
3 三聚氰胺标准品 纯度≥99.0% 1克 美国
4 一次性注射器(200支/包) 2mL 1包 国产
5 水系滤膜(100片/盒) φ50mm，0.45μm 1盒 上海
6 有机系滤膜(100片/盒) φ50mm，0.45μm 1盒 上海
7 针筒式有机相过滤器(100支/包) φ13mm，0.45μm 2包 天津
8 Elite MSP 三聚氰胺专用柱 ID:4.6×250mm，5μm 1支 依利特
9 混合型阳离子固相萃取柱(50支/盒) HyperSep Retain-CX，60mg/3mL 4盒 进口
测试用前处理配置包
序号 名称 规格级别 数量 产地
1 超声波水浴 AS3120型，3L,功率：120W 1台 天津
2 隔膜真空泵 GM型 1台 天津
3 溶剂过滤器 1000mL 1套 天津
4 分析天平 AL104，感量0.0001g 1台 进口
JD60-4,0.0001g 1台 沈阳
5 离心机 TG16G，16000转，6×50mL 1台 湖南
TD5G，5000转，12×10mL 1台 湖南
6 PH计 FE20K酸度计 1台 进口
6010酸度计 1台 上海
7 涡旋混合器 QL-861 1台 江苏
8 固相萃取仪 SPE-12 1套 天津
9 氮气吹干仪 PGC-01D 1台 天津

液相色谱仪标准配置包
序号 名称 数量
1 P1201三聚氰胺测试用液相色谱系统 1套
⑴P1201高压恒流输液泵 1台
⑵UV1201紫外可变波长检测器 1台
⑶ZWII型色谱柱恒温箱 1套
⑷Rheodyne 7725i 高压六通进样阀 1支
⑸Elite MSP 三聚氰胺专用柱 1支
⑹25µL微量进样器 1支
⑺100µL微量进样器 1支
⑻ZJ-1阀及色谱柱安装支架 1套
⑼EC2006色谱数据处理系统软件V1.0版 1套
⑽专用工具包 1套
2 高级配置(更多功能，人性化配置，工作效率更高)
⑴P1201S柱塞清洗单元 1套
⑵P1201溶剂管理器(含进口二元脱气机) 1套
⑶AS230固定体积型自动进样器 1套
3
升级配置(升级后，可在以后工作中检测多种样品，适用面更广，节约成本)
⑴P1201等度升级梯度配置包 1套
⑵AS230可变体积型自动进样器 1套
备注：如需分析饲料中的三聚氰胺，以上三个配置包所列仪器、试剂，都需配备，缺一不可。