血液中血清蛋白及其他球蛋白的分离方法

实验原理

带电质点在电场作用下，带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现象称为电泳。蛋白质分子具有许多可解离的酸性基团和碱性基团，在一定的pH条件下，它会解离而带电，在某一pH下，蛋白质分子中所带的正电荷数恰好等于负电荷数，即分子静电荷等于零。此时蛋白质分子在电场中不移动，溶液的这一PH值称为该蛋白质的等电点。

当溶液的pH小于该蛋白质的等电点，则蛋白质分子会结合一部分H离子而带正电荷，在电场中就会向负极移，反之，如果溶液的pH大于该蛋白质的等电点，则蛋白质分子会解离出一部分H离子而带负电荷，在电场中就会向正极移动。

由于各蛋白质的等电点不同，在相同的pH溶液中所带的电荷性质不同，电荷的数目不同，因而在电场中泳动的方向和速度也不相同，从而使混合样品中的蛋白质各组分得到分离。

本实验采用的醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜为支持物。醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少而无“拖尾”现象。

本方法快速省时、灵敏度高、样品用量少、操作简单，目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管病，肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术。

二、实验用品

  （一）器材

（1）电泳仪和卧式电泳槽。

（2）分光光度计。

（3）醋酸纤维薄膜。

（4）培养皿和点样玻璃片。

（二）试剂  

（1）巴比妥：巴比妥钠缓冲液

（2）染色液：称取0.5g氯基黑10B，加入蒸馏水40ml,甲醇50ml和冰醋酸10ml混匀，在具塞试剂瓶内贮存。

（3）透明液：冰醋酸25ml,加 95%乙醇75ml。

（4）漂洗液：乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml。

（6）定量洗脱液：0.4mol/L NaOH溶液。

材料

      新鲜血清（无溶血现象）。

三、实验程序

   （一）操作方法

  1.仪器和薄膜的准备

（1）酸酸纤维薄膜的剪裁和准备：醋酸纤维膜分成有光泽和元光泽面两面，选择无光泽一面，距离边沿1.5cm处划一条直线，然后把薄膜剪成2×8cm,将裁好的薄膜无光泽面朝下，漂浮巴比妥缓冲液上，若漂浮的薄膜在15~30S内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，可以用于电泳。让膜自然下沉，待膜完全浸透约0.5h后取出，夹在清洁的滤纸中间轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨光泽面和无光泽面。

（2）制作滤纸桥：剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层附着在电泳槽的支架上。使它的一端与支架前沿对齐，另一端浸入电极槽的缓冲液内，然后用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架制作相同的滤纸桥。它们作用是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的桥梁。

（3）平衡：用平衡装置，使两个电极槽内缓冲液的液面彼此处于水平状态，一般需要平衡15~20min。

2.点样

在薄膜无光泽的一面点样。点样在距负极端1.5cm处。点样时，用玻璃片沾上血清，先在滤纸上练习点样，使血清均匀分布在点样区，形成具有一定宽度，粗细匀称的直线，试点熟练之后，开始点在醋酸纤维薄膜上。

电泳

用镊子将目点样端的薄膜平贴在电泳槽负极支架的滤纸桥上，另一端平贴于正极，薄膜要紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。

染色

电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中染色5min，取出后用漂洗液浸洗脱色，每隔10min左右换一次漂洗液，连续更换3次，可使背景颜色脱去，将膜夹于干净的滤纸中，用电吹风的冷风将膜吹干。操作中，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。

结果判断

一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白，a1球蛋白，，a2球蛋白，β球蛋白和r球蛋白。

透明

取一条漂洗清楚的电泳薄膜，待干燥后浸入透明液中约5min,取出平贴于玻璃板上，使完全干燥，即成透明膜，电泳图谱仍清晰可见，可以长期保存。

定量洗脱法

用洗脱法测定各蛋白质组分的相对百分含量。将电泳图谱的各区带剪下，分别浸于盛有0.4mol/L NaOH溶液的试管中，清蛋白管加入4ml氢氧化钠溶液，其余每管加2ml氢氧化钠溶液，揺匀，放入37℃恒温水浴中浸提30min，每隔10min充分摇动一次，以便将色泽完全洗脱下来。该溶液颜色较稳定，在室温下24h内颜色强度无显著变化，然后在620nm波长处比色，测定各管的光吸收值。分别计算血清各部分蛋白质所占百分率。