对采用 UHPLC/MS/MS 准确定量玉米中毒枝菌素的稳定同位素稀释分析方法进行验证

摘要

本文介绍了一个快速、操作简单且经济有效的分析方法，用于定量分析谷类食品中所有 11 种受欧洲严格管制的毒枝菌素。基于Varga 等人发表的方法，本文提供了更多实用信息，以帮助其他实验室快速建立本方法。本方法包含两步溶剂提取程序，采用Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统进行UHPLC 分离，以及采用高灵敏度Agilent 6490 iFunnel 三重四极杆液质联用系统进行串联质谱检测。分别采用13C 均匀标记的各毒枝菌素作为 11 种目标化合物的内标，以此来补偿电喷雾离子化的基质效应。与其他方法不同，本方法的提取净化成本低、耗时短。此外，也无需繁琐地去制备基质匹配的标样。

采用玉米基质的方法验证实验表明，所推荐的两步提取程序基本能够提取完全（回收率 97 - 111%），因此，我们可以在提取后加入内标，并且仅需很少的量。针对加标玉米提取物的进一步实验表明，内标的使用可以使方法具有良好的准确度，表观回收率在88 - 105% 之间。我们通过对具有明确浓度的一些基质参考物质进行测定，证实了方法的准确度。

所有毒枝菌素的定量限(LOQ) 均低于欧洲法规针对谷类食品，甚至是谷类婴儿食品要求的浓度。本方法可实现玉米中所有受管制毒枝菌素的准确定量。分析其他谷类食品也能获得相似的提取回收率和准确度。本方法适用于多种分析物，除具有高准确度以外，最大的优势就是它的简便性，因此它对日常检验任务繁忙的实验室具有很大的吸引力。

前言

毒枝菌素是真菌的次生代谢产物，可对哺乳动物产生急性或慢性毒性。不良健康影响包括这些毒素导致的免疫抑制、肝毒性、致突变、致癌和雌激素活性。在已发现的数百种毒枝菌素中，有 11 种常常存在且有毒性，因此被认为是危害健康的主要因素。目前大约有100 个国家都建立了相关的管理法规。在欧洲，欧委会法规(EC) 1881/2006 及其修正案规定了以下11 种毒枝菌素在食品中最高含量：黄曲霉毒素（黄曲霉毒素B1、B2、G1 和G2 的总和，以及单独的AFB1 和黄曲霉毒素M1）、伏马菌素B1 和B2 的总和、赭曲霉毒素A (OTA)、棒曲霉素、脱氧雪腐镰刀菌醇 (DON) 和玉米赤霉烯酮(ZEN) 。黄曲霉毒素M1 和棒曲霉素只分别在牛奶和苹果中才须考虑，而镰刀菌毒素T-2 和HT-2 却在谷物中频繁被发现，已成为备受关注的公共健康问题。最近，欧盟委员会建议2013/165/EU 已发布，它针对谷物和谷类产品规定了指示性含量，据此，我们应该调查那些导致T-2 和HT-2 毒素出现的因素。俄罗斯已经开始监管谷物和谷类食品中的T-2 毒素。

若要确保所规定的最大限量标准得到有效执行，则需要有准确可靠的分析方法。对于多种残留物和污染物分析，液相色谱联用串联质谱已被证明是一款强大的工具。结果已表明，LC/MS/MS 可实现不同商品中多种毒枝菌素的同步测定，具有高灵敏度和高选择性。然而在复杂基质中，电喷雾过程中的基质效应可能会影响定量分析的准确性，它将导致分析物信号的抑制或增强。不仅在不同的商品间，而且在同一类基质的各样品间，基质效应的大小也无法预测。

目前可采用一些不同的策略来补偿基质效应，如稀释样品、基质匹配校准、添加标样，或使用内标。鉴于稀释样品会降低分析方法的灵敏度，而基质匹配校准的使用也有问题，因为一些毒素普遍存在于数种基质中（如玉米中的DON），并且一种商品的基质效应也会出现变化，从而使这种补偿也不能完全奏效。添加标样增加了每个样品的分析运行次数，因此时间效率较差。对于日常检验任务繁忙的实验室，最好是能够使用性质与目标化合物几乎完全相同但又有所不同的内标。过去，内标经常是单一化合物或一组化合物的类似物。然而，当我们希望补偿基质效应时，它的价值就很有限了，因为该效应与保留时间息息相关，而目标化合物极少与这些类似物共流出。

稳定同位素标记化合物是用于实现这一目的的理想选择，因为它们具有相同的理化性质（这意味着它们会与目标化合物共流出），而且由于它们的分子量不同，采用质谱技术仍可分辨它们。此外，它们并不存在于天然受污染的样品中。由于稳定同位素标记化合物的加入稀释了分析物同位素丰度的天然分布，故该过程通常称为稳定同位素稀释分析(SIDA) 。

本文介绍了一个快速、可靠且操作简单的分析方法，采用 UHPLC/MS/MS 定量分析谷类食品中黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）、伏马菌素（FB1、FB2）、OTA、DON 和ZEN，以及T-2 和HT-2 毒素。为确保准确的定量分析，我们在分析中使用了各目标分析物的13C 均匀标记的同系物作为内标。本方法包括一个无需进一步净化的两步萃取程序、UHPLC 分离和使用动态MRM 的高灵敏度MS/MS 检测。本方法顺利通过了基于玉米基质的验证，评估测定的方法性能参数包括线性、基于信噪比 (S/N) 的LOQ，以及重现性。我们通过分析具有明确浓度的一些测试材料证实了方法的准确度。Varga 等人对所有提供的结果进行了详细发表。

结论

本文建立了一个快速简便的UHPLC 多目标分析方法，用于对欧洲监管的谷类食品中所有毒枝菌素进行准确定量分析。它充分利用了1290 Infinity 液相色谱系统的低延迟体积，以及在UHPLC 分离中可靠地操控高背压的优势，提高了色谱分离度并减少了运行时间。本方法还得益于Agilent 6490 三重四极杆液质联用系统固有的高灵敏度，这对于实现与谷类婴儿食品中AFB1 和OTA 法规限度一致的LOQ 尤为重要。考虑到样品前处理中10 倍的稀释，该方法就更加有意义。另外，采用本方法还能够在运行中实现正/负极快速切换，使我们可以利用每个化合物丰度最高的离子化模式进行分析。由于本方法可以同时分析理化性质差异显著的分析物，因此它也可以实现更多毒枝菌素的分析。

方法包括一个快速、简便且低成本的两步溶剂提取程序，可以获得良好的回收率，因此加入的13C 标记内标可以保留在终提取液中，它们可以补偿电喷雾离子化过程中的基质效应。方法使用玉米基质成功通过了验证，所有基质效应得到了有效补偿，并提高了定量分析的准确度。玉米被认为可产生复杂的提取物，引起严重的基质效应。在玉米基质上运行良好的方法也很可能会应用到其他谷物和谷类食品分析中。

同时也采用该方法对加标OTA 的红酒进行了分析。基质效应同样得到很好补偿，实现了红酒中OTA 的高准确度定量分析，即使它展现出完全不同的基质特性。

该方法应用每个13C 标记内标增加的成本从HT-2 和T-2 毒素内标的0.02 欧元到FB2 内标的0.48 欧元不等，对于所有11 个内标，每个样品总的追加费用少于3.80 欧元。原始和13C 标记的毒枝菌素可以从罗默实验室诊断股份有限公司（图尔恩，奥地利）的 LC/MS 毒枝菌素试剂盒（部件号KIT-001）中获得。购买该试剂盒，并采用1290/6490 联用系统，实验室可以很容易地复制该方法，仅需应用列出的同样的分析条件。