抗体药物偶联物综合分析的一体化工作流程——采用微流控 HPLC-Chip/MS 技术

摘要

本研究使用安捷伦 HPLC-Chip 解决方案和飞行时间 (TOF) 质谱仪开发出一套测定抗体药物偶联物完整质量数、去糖基化完整质量数、药物/抗体比率以及多糖组成的高度自动化的集成分析方法。

前言

抗体药物偶联物 (ADC) 属于新一代靶向生物药物，合成方法是将细胞毒素剂通过连接物连接至靶向特定细胞的单克隆抗体 (mAb)。偶联化学方法有包括半胱氨酸连接、赖氨酸连接和位点特异性偶联在内的多种类型， 需要根据偶联化学类型选择不同的表征方法。

ADC 具有高效、高选择性和低毒性的特点，其生产与表征比传统 mAb 更为复杂。需要采用严格质量控制以确保 ADC 具有恒定的多糖组成和药物/抗体比率 (DAR)。取得适合的 DAR 对于 ADC 效率优化和毒性最小化至关重要。DAR 与多糖组成的测定常采用液相色谱/质谱 (LC/MS) 法。去糖基化通常在分析前离线完成，目的是降低用于 DAR 计算的 ADC LC/MS 分析结果的复杂性。

本应用简报介绍了一种采用安捷伦 HPLCChip 解决方案和飞行时间 (TOF) 质谱仪测定赖氨酸连接 ADC 完整质量数、DAR 和多糖组成的新型快速一体化工作流程。分析完整 ADC 时，采用标准蛋白质鉴定芯片与反向色谱柱对不同种类糖基化和药物偶联物质进行分离。采用 mAb-ProtID 芯片（配备含固定化 PNGase F 酶的在线反应器）以及反相富集与分析色谱柱测定去糖基化质量数与 ADC DAR。具有相同去糖基化反应器的另一种芯片以及多孔石墨化碳富集与分析色谱柱可用于表征所释放的多糖。该系统可分析纳克级的上样量，且所有分析均可在 15 min 内完成。此外，在线去糖基化提供的解决方案可适用于所有多用户临床研究实验室。

结论

本文采用 HPLC-Chip 技术开发出了一套自动化一体式微流控 ADC 表征的工作流程。分析完整 ADC 时，不同药物偶联种类的分离由标准蛋白质鉴定芯片以及反向色谱柱完成。首先在具有固定化 PNGase F 酶的芯片上对 ADC 进行在线去糖基化，随后使用反相富集与分析色谱柱对去糖基化 ADC 种类进行分离。分析多糖时，在完成在线去糖基化后使用多孔石墨化碳富集与分析色谱柱对 N-糖链进行分离。这一新型微流控纳升 LC/MS 工作流程能够高度重现地测定 ADC（ 糖基化和去糖基化）的精确质量数，结果与预期质量数差值不超过 10 ppm。采用安捷伦 DAR 计算器可得出 RSD 低于 5 % 的高重现性 DAR 比率。每次 ADC 或多糖分析需要 15 min 的分析时间。采用这种一体化微流控纳升 LC/MS 工作流程时仅需纳克级 ADC，在自动化分析过程中使用固定化酶反应器进行 ADC 在线去糖基化可缩短分析时间。