使用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱分析聚乙二醇化蛋白质

摘要

通过聚乙二醇化能够改变治疗性蛋白质的物理化学和生物性质（如提高溶解度、降低免疫原性、延长半衰期以及防止蛋白酶破坏），从而显著提高其价值。体积排阻色谱法 (SEC) 是检测分子量大于聚乙二醇化蛋白质杂质的首选方法。由于聚乙二醇介导的与硅胶固定相的相互作用会导致回收率降低、峰形变差以及过度拖尾，因此聚乙二醇化蛋白质的 SEC 分析面临着很大挑战。本应用简报描述了一种用于检测聚乙二醇粒细胞集落刺激因子 (PEG GCSF) 的简单而灵敏的 SEC 方法。采用 AdvanceBio SEC, 130Å, 7.8 × 300 mm, 2.7 μm 色谱柱在水相流动相下进行 PEG GCSF 的分离和定量分析。线性曲线在 12.5-2000 μg/mL 的范围内具有优异的相关系数，表明该方法适用于定量分析。该方法具有出色的保留时间和峰面积精度，证明了该方法的适用性。此外，AdvanceBio SEC 还可对强制应激研究中得到的聚集体进行分离与定量分析。

前言

聚乙二醇化是聚乙二醇 (PEG) 聚合物链与另一个分子发生共价结合的过程，另一个分子通常是药物或治疗性蛋白质。将 PEG 的活性衍生物与目标大分子共同温育通常可实现聚乙二醇化。PEG 基团具备的多项优势有助于提高蛋白质稳定性并延长体内的循环半衰期。美国食品药品监督管理局 (FDA) 已批准 PEG 为公认安全物质。目前已有集中聚乙二醇化产品通过了 FDA 的审批。聚乙二醇粒细胞集落刺激因子 (PEG GCSF) 是一种长效的重组 GCSF，其中含有 GCSF 以及 20 KDa 与甲硫氨酸残基 N 端共价结合的聚乙二醇分子。GCSF 是一个含有 175 个氨基酸的蛋白质，分子量为 18800 道尔顿。PEG GCSF 的总分子量为 39 KDa。各论草案方法推荐使用体积排阻色谱 (SEC) HPLC 测定 PEG GCSF 和更高分子量聚集体的纯度。多数针对 PEG GCSF 的已发布方法采用含有 100 mM NaCl、85% 磷酸以及最多 10% 乙醇的水相流动相以减少非特异性相互作用并改善峰形和分离性能。聚集体有时会比自然形态更易于与固定相结合，因此治疗性蛋白质的不理想吸附是 SEC 分析过程中的一个主要问题。由于这一优先结合趋势，聚集体的 SEC 分析往往并不准确，甚至存在无法检出的风险。使用含有机溶剂或极端 pH 的流动相可解决这一问题，结果表明这种流动相能够提高分离度和回收率。然而，除可能会使可逆聚集体解离外，这种流动相还可能会使配方缓冲液中不可逆的聚集体发生解离。

本文展示了用于 SEC 分析的突破性技术 Agilent AdvanceBio SEC, 130Å, 7.8 × 300 mm, 2.7 μm 色谱柱的优势。这款色谱柱采用创新型硅胶填料和特有的亲水键合技术，可使各种样品均获得出色的分离度和体积分离，且无需向流动相中添加有机改性剂。

结论

本应用简报证明了采用 PEG GCSF 作为模型蛋白质进行聚乙二醇化蛋白质分析的几个出色的解决方案。文中开发出了一种采用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱，无需在流动相中添加有机改性剂即可监测 PEG GCSF 纯度的简单 SEC HPLC 方法。该方法具有优异的 RT 和峰面积 RSD，并能满足 PEG GCSF 系统适用性要求。PEG GCSF 的 LOD 和 LOQ 分别为 3.125 μg/mL 和 12.5 μg/mL，表明该分析方法具有较高灵敏度。12.5-2000 μg/mL 的 8 个标准偶合物浓度的线性曲线具有极佳的线性相关系数值，表明该方法可实现准确定量分析。此外，治疗性 PEG 蛋白质的应激研究还表明 AdvanceBio SEC 色谱柱可对聚集体进行分离和检测，并能根据峰面积比进行定量分析。将这一简单的重现方法与仪器的生物惰性和耐腐蚀相结合，可使这类解决方案成为生物制药研究中聚乙二醇化蛋白质 QC 分析的可靠适用方法。