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从手动到自动：高通量克隆形成率分析技术的创新突破

安捷伦

2024/09/13 16:52

阅读：6

关于

Colony Formation Assay

Colony Formation Assay——克隆形成实验，是测定细胞存活率和考察单个细胞增殖能力的有效方法，属于一种细胞表型实验。在细胞克隆实验中，克隆形成率是一个关键指标。

Colony Formation Assay 的重要作用

克隆形成实验可以用于检测细胞干预是否影响细胞的增殖和存活能力；

通过体外克隆形成能力强弱来评价细胞在体内的成瘤性；

对癌症药物筛选来说，克隆形成实验可以通过验证肿瘤细胞在特定的环境下的增殖能力方面的敏感性，用于药物筛选及肿瘤免疫治疗的效果评估。

手动实验方法：

手动的克隆形成实验，通常将对数生长期的单层细胞消化离心，倍比稀释后以 50、100、200 个细胞的梯度密度接种于 6 孔板中静置培养，中间给与细胞处理，细胞增殖形成克隆后结晶紫染色，显微镜下肉眼观察并计数，选取 50 个细胞以上的克隆进行克隆形成率计算。

图 1 基于 6 孔板的传统克隆形成计数，并非每一个细胞群都可以算是一个克隆

手动克隆形成试验对操作人员的操作技术和经验依赖较高，通常使用低密度孔板（6 孔板）便于显微镜下手动计数。这种方法限制了通量，并依赖于主观定量。

在 AI 时代，检测技术和方法的进步带来的不仅是高效稳定，同时客观真实且数据可溯源。

自动化常常意味着可以提高通量，从而节省大量的操作和时间成本，对于克隆形成实验来说也是如此。Agilent BioTek Cytation 7 细胞成像多功能微孔板检测仪的定量显微成像技术，可以在 6-96 孔板中完成克隆形成实验的自动化成像与分析过程：全孔成像，自动识别、量化和表征克隆。

更高的通量可以帮忙研究者在更短的时间内，获得更可靠的具有统计学意义的数据，无论是在重复性方面，还是在更广泛的药物剂量范围需求内。

图 2，使用 Agilent BioTek Cytation 7 在 6 孔板和 96 孔板中进行克隆成像实验的示意图

通常，判断一群细胞是否是一个克隆的标准是细胞群中的细胞数量不少于 50 个，人工手动计数费用费力，智能化时代如何快速对克隆形成进行判断呢？

Cytation 7 自动化显微成像提供的巧妙算法

——准确且高效

对孔板中的细胞进行结晶紫和 Hoechst 33342 染色(图 3A 和 3D)，然后使用荧光通道进行成像，双 Mask 分析分别识别并标记细胞群边界（一级 Mask）和细胞群内的细胞(二级 Mask)

以此建立细胞群面积与细胞数量相关联的线性方程(图 3B和 3E)，由此方程估算 50 个细胞组成的面积，进而用于校准细胞分析工作流。

在后续的高通量分析中，使用彩色明场成像模式进行全孔成像，并应用之前确定的阳性克隆面积进行分析：至少包含 50 个细胞的克隆亚群才可以被标记和量化(图 3C 和 3F)。

图 3，克隆大小与细胞数量的相关性.通过荧光成像结晶紫和 Hoechst 33342 染色的 Caco2 (A) 和 HeLa (D) 克隆。拟合克隆面积与细胞数量（细胞核）的相关性，通过线性方程计算含 50 个细胞的克隆的估算面积，Caco2 和 HeLa 细胞的 50 个细胞集落面积分别为 1.03×10⁶ 和 9.0×10⁵μm²。这些值应用于结晶紫染色菌落 (C 和 F) 的彩色明场图像。比例尺= 200 μm

Agilent BioTek Cytation 7 是一款独特的细胞成像多功能微孔板检测仪，同时具备宽场倒置荧光显微镜、正置明场显微镜和强大的图像分析工具，非常适合于以 6 孔板和 96 孔板进行自动化克隆形成实验。

图 4，使用 96 孔板进行克隆形成实验

Cytation 7 除了能够提供高质量图像用于定量分析之外，其自动化分析速度也非常快。

5 分钟，完成基于 96 孔板的克隆形成分析，从图像捕获到得出数据。

30 分钟，完成 6 块 6 孔板的克隆成像、识别和量化分析，包括生成 11 个药物浓度处理的 EC50 剂量响应曲线。相比之下，手动操作可能需要 4 个小时。

表 1，Cytation 7 在 6 孔板和 96 孔板上进行克隆形成分析时间

我们为克隆形成实验开发了一种快速、定量和可靠的方法，利用 BioTek Cytation 7 细胞成像多功能微孔板检测仪的正置显微成像模式来自动化成像，并使用强大的图像分析工具来定义细胞阈值对克隆进行客观检测和定量。这种自动化解决方案提供了符合统计学意义的稳定可靠的数据采集结果、灵活的通量选择，并大大的缩短时间周期，这对癌症研究等相关的药物开发应用至关重要。

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