活细胞监测：优化高级细胞模型的工作流程》

瑞典当地时间2022年10月初，美国科学家‍‍卡罗琳·贝尔托西 (Carolyn R. Bertozzi)等人因为对“为点击化学和生物正交化学的发展”‍‍做出的贡献荣获2022年诺贝尔化学奖，她也是诺贝尔化学奖史上第8位女性获奖者。今天我们要分享的研究成果就来自她最近（2022年9月）发表于Science的一篇研究。

病毒已经进化到可以“黑客”胞吞机制来进入细胞。溶酶体的组织蛋白酶介导了呼吸道肠道病毒颗粒的分步蛋白降解，这一过程对病毒感染细胞至关重要。在病毒进入过程中，组织蛋白酶还能裂解几种包膜病毒糖蛋白，引发生产性感染，包括高致病性病毒，例如丝状病毒家族成员埃博拉病毒（EBOV）和SARS-CoV-1、MERS和SARS-CoV-2冠状病毒。但是这一重要过程的“主角”一直没有被揭示。

2022年9月8日，美国斯坦福大学贝尔托西等人在线发表题为“The human disease gene LYSET is essential for lysosomal enzyme transport and viral infection”的研究论文。该研究通过基因组规模的CRISPR筛选与鉴定，最终发现溶酶体酶运输因子（Lysosomal Enzyme Trafficking factor, LYSET）对依赖组织蛋白酶的病毒的感染至关重要。

众所周知，溶酶体是细胞内的关键降解区域。向溶酶体的转运依赖于 GlcNAc-1-磷酸转移酶介导的可溶性酶与 6-磷酸甘露糖 (mannose 6-phosphate, M6P) 的标记。GlcNAc-1-磷酸转移酶缺乏会导致严重的病理反应。LYSET能够通过与GlcNAc-1-磷酸转移酶结合并将其保留在高尔基体中，缺乏LYSET导致M6P标记的全局丢失和GlcNAc-1-磷酸转移酶从高尔基复合体到溶酶体的错误定位。

为了在细胞实验中证明LYSET的重要功能，研究人员构建了表达埃博拉病毒糖蛋白的水泡口炎病毒且带有绿色荧光蛋白（VSV-EBOV-GP）用于侵染野生型293FT细胞和LYSET缺陷型的293FT细胞。然后利用赛多利斯Incucyte® 实时活细胞分析系统获得病毒侵染实验结果。

图1
通过检测GFP绿色荧光，Incucyte® 可以非常方便且高效的监测连续12小时内的病毒侵染情况（图1 E）。从图中可以看出，LYSET敲除的细胞不会有病毒感染，拍摄时间间隔为1小时，能够非常清晰的从第4小时开始观察到不同的趋势，并且平行样品之间的差异（error bar）很小。

紧接着，研究人员也构建了VSV-SARS-COV-2，利用相同的方案，在HAP1、Primary Fibroblasts、A549等细胞系中得到了一致的结论——LYSET是病毒侵染细胞的关键宿主因子！

图2
研究人员进一步构建了敲除LYSET基因的小鼠。LYSET敲除小鼠表现出类似MLII的表型，而人类致病性LYSET等位基因未能恢复溶酶体分选缺陷。进而确定LYSET是M6P运输机制正确运作所必需的。

为什么这篇文章要用Incucyte® 呢？

- 培养箱内可长达数周的连续观察，最短几分钟间隔拍摄；本次实验12小时总体读取时间，每隔1个小时读取一次，大大减少人力操作，并且不像流式需要对细胞进行预处理，使得结果更准确。

- 6个板位，分别独立设置检测程序，可以兼容各种孔板和培养皿，通量高；本篇文章有各种细胞以及病毒实验组，Incucyte® 一次可以完成所有实验组实验。

- 高效简便的模块化软件设置和数据分析，输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数。

- 大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的Protocol；文章数大于12000篇，是长时间活细胞成像产品中最多。

Incucyte® 在监测Time-plot的同时还能生成清晰度与分辨率俱佳的video，让数据不再枯燥，让结果可信度更高！

限于篇幅，浅举两例供请大家欣赏：

诚然，百闻不如一见，当我们眼见为实的看到绿色荧光随时间变化的视频，感官直觉总能比Time-plot来的更直接，更震撼！

诺奖获得者都在用的技术，你不想试一试吗？

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