在药物药理开发中，皮肤模型和离体皮肤被广泛用于皮肤渗透研究。皮肤模型和离体皮肤的环境参数，如孵育和培养条件的改变会影响细胞反应，从而影响实验结果的相关性。然而，现有的检测系统，如Franz扩散室仅能在接收介质中测量这些参数，而不是评估组织细胞中的实际情况。开放式微灌流（OFM）是一种用于临床和临床前药物开发研究和生物标志物研究的采样技术。OFM可以从各种组织（如皮肤、脂肪组织、大脑的间质液(ISF)）中连续取样分析物。有研究人员将OFM和微流控生物传感器相结合，设计了一种实时采样监测系统，用于在线监测人3D全层皮肤组织培养参数。研究内容详情如下：为了减少、避免动物实验，各种人体组织模型已被陆续开发出来，特别是在皮肤组织工程领域，研究人员已经培养出高度先进的皮肤模型，可以非常接近地模拟天然皮肤，用于研究免疫反应，烧伤伤口和伤口治疗等。在离体实验中，这种体外皮肤模型比使用手术来源的离体皮肤更具有优势。离体皮肤能够表现出供体差异，但体外模型的组装可以实现标准化，产生可复制的产品，从而得到可靠和可转移的结果。体外组织培养参数（如氧、pH值、葡萄糖或乳酸）的改变会对细胞行为产生不利影响，从而影响数据的相关性。目前这些参数仅仅是在组织培养基中测量得到的，我们最近的研究证明了这些参数在体外3D培养模型中的实际值与在培养基中测量的值有很大差异。只有在组织内可靠地监测这些参数才能严格控制实验条件。对于复杂的3D组织模型，开发微创无损、可靠、可重复、实时的分析方法，可以促进对组织存活率、发育、功能和细胞反应的连续或重复分析和监测。一些商业化的系统，如Franz扩散池是测定离体皮肤或体外皮肤模型经皮给药的最重要方法之一。然而，这种方法只能监测受试物质在接收介质中的浓度，而不能给出组织内实际浓度和状态信息。在本研究中，我们开发了一种采样设计，将开放式微灌流（OFM）采样技术与微流控生物传感器相结合，通过实时测量全层皮肤模型和离体皮肤中的氧气、葡萄糖、乳酸和pH值，来在线监测关键细胞培养参数。为了验证这种在线监测系统，我们对体外3D全层皮肤模型（FTSE） 真皮层和相应的培养基中的氧气、葡萄糖、乳酸和pH值进行了实时评估。此外，我们还比较了阿昔洛韦、利多卡因和双氯芬酸在皮肤模型和离体皮肤中的渗透。
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图1. 体外培养箱的一般设置有(1)气候控制单元，(2a和2b)加热器，(3)加湿器(右侧第二个加湿器未显示)，(4)带有FTSEs的采样单元，(5)OFM泵，(6)在线监测流通池。
OFM通过插入一个开放式的微创无膜探针来直接进入ISF。OFM能够对亲脂和亲水化合物、蛋白质结合和非结合药物、神经递质、多肽以及蛋白质、抗体、纳米颗粒和纳米载体、酶和囊泡进行采样。因此，无论分析物的分子大小、蛋白质结合特性或亲脂性如何，OFM取样都可以获得ISF的全部生化信息。
图2. A植入OFM探针、O形贴片和取样瓶的人体离体皮肤。B（1）FTSE与(2)植入OFM探针和(3)O形贴片的详细设置，以避免交叉污染并确定应用区域的大小。C在线监测设置：(1) FTSE，(2)用于氧气和pH的主流通池，(3) FireSting-PRO多分析物测量仪，(4)用于葡萄糖和乳酸的第二流通池，以及(5) 6通道生物传感器测量仪器(Jobst Technologies)。通过在OFM探针出口后连续连接两个独立的流通池，在线监测氧、pH值、葡萄糖和乳酸(图2C和3)。流通池经过优化，使其在流速为1 µL/min时，经过温度补偿后，能够实现合理的响应时间、准确性和精确度。由PEEK（聚醚醚酮）制造的OFM探针对氧气不透过，因此能够从OFM样本中进行精确的定量分析。
图3. (A)渗透实验的设置：从OFM袋中泵出的灌注液通过植入FTSE（局部涂抹乳膏）的 OFM探针(黄色)，由泵头2抽出。在位置1收集用于离线分析阿昔洛韦、利多卡因和双氯芬酸浓度的OFM样品。在位置2收集用于离线分析葡萄糖和乳酸的OFM样品。(B)用于在线监测氧气和pH值的定制微流控流通池：通过管道和光纤连接进行数据读取。全层皮肤模型（FTSE）与离体皮肤的制备类似，通过植入OFM探针，附着O形贴片，连接OFM泵，管道，在线监测系统和采样瓶。OFM开放式微灌流——质谱前端活体采样微灌流技术
可用于小分子/大分子药物，亲水/亲脂性物质，多肽，蛋白，抗体，结合药物与游离药物，转运体，酶，纳米载体和囊泡等的取样，同时分别检测PK与PD；
可以通过OFM直接在目标组织对所要分析化合物进行取样，然后进行随后的质谱检测，取样时间可长达48小时。
产品类型：
皮肤开放式微灌流 dOFM
脂肪开放式微灌流 aOFM
脑部开放式微灌流 cOFM
咨询热线：400-0880-782
选择市售的乳膏来测试其活性药物成分（API）阿昔洛韦、利多卡因和双氯芬酸的渗透能力，这些API在皮肤组织上的渗透能力是不同的（表1）。通过测量培养基和FTSE组织中的API浓度来监测FTSE渗透。使用药膏后每小时收集一次利多卡因和双氯芬酸样品，持续12小时。由于阿昔洛韦先前在初步实验中表现出的渗透速度要慢得多，因此在应用后24小时收集样品。通过计算曲线下面积(AUC)比较FTSE和离体皮肤中的API浓度。
表1. 所使用乳膏及其活性成分和剂量列表
使用OFM来监测体外FTSE和离体皮肤的培养参数，两者都位于受控条件下的体外培养箱中(图1)。FTSE和离体离体皮肤在培养箱中培养24小时，同时监测上述参数以评估组织是否保持活力。培养基中的氧水平相对稳定在190.7±2.7 hPa，与环境空气中的氧浓度相对应(图4A)。相比之下，FTSE样品中测量的氧浓度较低，为71.6±36.8 hPa。在离体皮肤中未检测到氧气。
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图4. 在FTSE（绿线）、皮肤切片（红线）和培养基中（蓝线表示氧气(A)和pH值(B)）在线测量的组织参数，以及在培养基中离线测量的葡萄糖(C)和乳酸(D)（蓝点）。
培养基的pH水平从7.75增加到9.25，而离体皮肤和FTSE样品的pH值在7.5到8.0之间相对恒定。在最初几个小时内，离体皮肤的pH水平与FTSE pH值水平相似，但随着时间的推移略有下降(pH值= 7.60)(图4B)。培养基中的葡萄糖水平保持相对恒定，为328.8±33.3 mg/dL。相比之下，FTSE样本中的葡萄糖水平约为171.5±26.9 mg/ dL，随着时间的推移略有下降(图4C)。离体皮肤中未发现葡萄糖。介质中乳酸水平从0到30 mg/ dL呈线性增加。在FTSE样本中测量的乳酸水平在第10至18小时之间显示出类似的趋势，水平约为60 mg/ dL。随后，FTSE中的乳酸水平降至低于初始乳酸水平。离体皮肤样本中的乳酸水平比FTSE低约2倍(图4D)。图1和3实验设置用于评估阿昔洛韦、双氯芬酸和利多卡因对FTSE的渗透。在所有渗透实验中，来自FTSE组织的OFM样品中的API水平明显高于培养基(图5)。一般来说，API浓度在培养基中积累，而FTSE组织中的浓度在不同的时间点达到最大值，然后由于进一步渗透到培养基中而下降。对于阿昔洛韦，在应用后6-12小时观察到FTSE组织中的最大浓度(图5D)，而双氯芬酸则不清楚主峰是在取样后12小时内出现还是浓度仍在增加（图5E）。利多卡因的最大浓度在3小时后观察到(图5F)。
图5.使用阿昔洛韦(A、D)、双氯芬酸(B、E)和利多卡因(C、F)对FTSE(n = 3)进行渗透试验。通过OFM取样测定FTSE培养基(A-C)和FTSE组织(D-F)中的 API浓度。当将FTSE组织与离体皮肤进行比较时，在任何采样时间，来自FTSE组织的所有OFM样本都比来自离体皮肤的OFM样本具有更高的阿昔洛韦、双氯芬酸和利多卡因API浓度(图6A-C)。FTSE组织中的总API浓度(曲线下面积)也明显高于离体皮肤(图6D)。
图6. 来自FTSE(n = 3，绿色)和离体皮肤(n = 4，红色)的OFM样品中(A)阿昔洛韦，(B)双氯芬酸和(C)利多卡因的API浓度。(D) FTSE(绿色)和离体皮肤(红色)中OFM样品中API总浓度的比较。准确测量ISF中的实际参数可以帮助：(i)更好地控制培养过程，(ii)改善培养条件，最终(iii)开发出更好的离体模型。在上述研究中，我们对这些参数进行了直接测量。培养基中的pH值升高，可能是CO2从培养基转移到周围空气中，导致碱化。相比之下，FTSE样品中的pH值保持相对稳定，可能归因于FTSE中活细胞的乳酸生成。特别是氧气和葡萄糖的供应明显低于培养基样品所显示的水平。在离体皮肤样本中，没有检测到葡萄糖，说明离体皮肤没有新鲜的营养物质供给，可以用血液再循环缺失来解释。相比之下，氧和葡萄糖水平在FTSE中可以保持稳定24小时。在采样时间结束时，FTSE中的乳酸水平大幅下降，这可能与乳酸传感器的灵敏度损失有关。渗透到皮肤模型不同皮肤层的药物量无法估计，是皮肤模型研究中遇到的一个主要问题。通过使用OFM，我们能够测量FTSE真皮中API的实际浓度。我们发现其API浓度明显高于相应的细胞培养基。这表明，组织细胞暴露于比培养基测量浓度高得多的API中。表1中，FTSE的渗透范围从慢速(阿昔洛韦)到中速(双氯芬酸)到快速(利多卡因)。对于离体皮肤，阿昔洛韦表现出比预期更好的渗透性，这可能是因为阿昔洛韦能够借助毛囊途径穿过角质层。与离体皮肤样品相比，FTSE中的API浓度更高，这表明FTSE的屏障功能弱于离体皮肤。对于包含皮下组织的三层人体皮肤模型，OFM技术能够在不同深度和层次进行多种物质的时空测量。OFM数据不仅可以帮助更好地理解渗透速率，还能揭示物质在不同皮肤层中的停留时间或积累情况。结合具有与体内皮肤相当屏障功能的先进皮肤模型，在未来OFM技术可以更准确地表征药代动力学。综上所述，本研究所提出的将OFM微灌流取样和微流控生物传感器相结合，用于在线监测培养参数的先进方法，能够使我们更准确表征体外皮肤模型和离体皮肤。这有助于更好地控制体外培养，并开发出更具生理特性的皮肤模型。此外，在渗透实验中监测FTSE真皮层和离体皮肤中的API，可以确定组织中细胞实际暴露的物质浓度。这可能使皮肤模型中的药物渗透实验表征更加准确，从而减少或避免动物实验的使用。
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