文献分享 | IF:15，基于深度学习的智能分析系统自动识别并评估3D肿瘤模型

背景及摘要

三维体外肿瘤模型比二维模型提供更符合生理学的相关药物反应，但现有的3D肿瘤侵袭分析方法主要涉及对肿瘤大小和特定方向上的侵袭距离进行简单测量。这些测量方法存在不足，因为肿瘤形状通常不能很好地描述为圆形，并且由于周围细胞外基质（ECM）的异质性，不同方向上的侵袭距离通常并不均一。此外，手工进行肿瘤成像和绘制肿瘤球体边界既耗时又有主观性。这些问题限制了3D肿瘤球体在工业高通量药物筛选中的应用。三维肿瘤模型分析的新方法具有重要意义（图1）。

图1. 三维肿瘤球体分析的新方法具有重要意义。2D肿瘤培养模型过于简化。3D肿瘤球体培养模型更为精确，但现有方法仅测量肿瘤大小和肿瘤球体内的ATP活性，忽略了有关细胞侵袭性的信息。

为此，我们通过建立一个准确的自动化3D肿瘤分析系统并利用人工智能（AI）执行3D肿瘤球体边界检测。提出了两个评估三维肿瘤侵袭性的新指标——额外周长指数（EPI）和多尺度熵指数（MSEI），并将这些指标与一种新的基于卷积神经网络的算法结合起来，用于肿瘤球体边界的检测。这种新的3D肿瘤边界检测和侵袭性分析算法比其他任何现有算法都更加精确。我们将这种球体监测和基于人工智能的识别技术（简称为“SMART”）应用于评估从肿瘤细胞系和原代肿瘤细胞在三维培养中生长的肿瘤球体的侵袭性。

研究结果

开发用于分析肿瘤球体侵袭性的指标及球体边界检测

生成肿瘤球体后，为了开发更准确的定量指标来评估肿瘤侵袭性，我们利用了现有的球体分析参数，包括原始半径、核心半径、侵袭半径、面积、周长和圆度。此外，我们定义了两个新的肿瘤侵袭性指标，称为额外周长指数（EPI）和多尺度熵指数（MSEI），以分析3D水凝胶系统中的球体侵袭。EPI是肿瘤球体周长与其等效周长的比率。该参数与球体周边的突起数量和大小相关。

采用基于深度学习的算法自动区分肿瘤球体的边界，并开发了一个完全自动化的成像系统和肿瘤球体形成套件，以标准化每一个步骤。该系统包括全电动控制阶段，能够执行自动聚焦、球体自动居中，以及使用深度学习网络进行自动边界检测（图3）。深度学习网络是基于修改的U-net结构的卷积神经网络。简单来说，每个球体的图像被转换成灰度图像，并输入到卷积神经网络进行特征提取和边界识别。网络经过训练，能够识别肿瘤球体的边缘。提取特征后，对其进行了语义分割网络评估。原始图像被重新组合，并通过使用轮廓勾画方法和后处理步骤来获得球体的边界（图3）。

图3. 基于深度学习算法识别浸润性肿瘤球体的边界：(A)开发用于自动化的SMART系统成像和分析。(B)球体边界检测深度学习算法执行步骤示意图。首先，从每张图像中随机提取斑块；其次，将输入的patch提交给语义分割网络进行计算；最后，对分割结果进行重组，利用轮廓圈定法和后处理步骤将计算出的轮廓与原始图像重叠，得到椭球体边界。(D) PSP-U-Net预测的球体边界样图。将原始图像输入到网络中，网络识别并预测球体的位置和覆盖范围，则系统生成与原始图像和预测边界重叠的输出图像，并将它们合并在一起。

利用明场成像技术开发深度学习方法并进行球体边界检测

我们的PSP-U-Net与现有的图像分割方法相比较（图4A）。PSP-U-Net在性能上轻松超越了其他广泛使用的阈值分割方法。PSP-U-Net在背景噪声较高（图4）以及球体与周围Matrigel对比度不高时（图4）仍能正确工作。我们进一步研究了训练PSP-U-Net对肿瘤球体预测的影响。图4B展示了在不同训练阶段预测出的肿瘤球体。值得注意的是，尽管在训练初期，PSP-U-Net会错误地将图像中的一些污点识别为球体的一部分，但经过82,500次训练迭代后，这类错误便不再出现。图像分析的准确性随着训练次数的增加而提高，这一点通过F值——一个通过比较预测结果与真实值计算得出的指标——得到了评估（详见材料与方法）。F值在最初的20,000次训练迭代内迅速上升，然后在125,000次训练迭代后稳定在0.95以上（图4C）。改进的PSP-U-Net在准确性上超越了其他深度学习网络（图4D）。

图4. PSP-U-Net算法的特性分析与其他算法的比较。(A) 在不同成像条件下，使用三种不同方法（阈值法、U-Net和PSP-U-Net）进行边界识别的细胞示例。放大图像比较了通过阈值法或PSP-U-Net算法计算的球体边界。(B) 不同训练轮数后肿瘤球体识别结果。(C) 以PSP-U-Net的训练轮数为函数，通过F值评估的肿瘤球体预测的准确性。随着训练轮数的增加，图像分析的准确性得到提高。(D) 不同算法的准确性比较，显示出修改后的PSP-U-Net算法在相同数量的训练轮数（20万次）后，在所测试的算法中产生了最高的准确性。

SMART系统用于3D肿瘤模型抗癌药物疗效检测

在SMART系统的帮助下，使用五种癌细胞系和五种抗癌药物（阿霉素（Dox）、多西他赛（Doc）、紫杉醇（Pac）、环磷酰胺（Cyc）和5-氟尿嘧啶（5-Fu））来确定3D肿瘤球体模型中的药物疗效。肿瘤球体在药物剂量是2D培养中相同细胞系确定的IC50剂量的50-100倍时仍保持活性。然后我们在药物治疗期间测量了肿瘤球体的活性、大小、EPI（额外周长指数）和MSEI（多尺度熵指数）。基于这些结果，癌细胞系被分为两类：侵袭性（MDA-MB-231、MDA-MB-435S、A549、NCI-H23）和侵袭性较小（MCF7）。在侵袭性类别中，未处理的对照球体的尺寸随时间增加，而药物治疗减弱了这种尺寸增加（图5A和B）。在大多数侵袭性细胞中，除了Cyc之外，所有测试的抗癌药物都能完全或部分抑制细胞侵袭。这些结果表明，通常用作癌症药物疗效指标的球体大小可能不是一个可靠的指标。

图5. 未处理对照样本和经药物治疗样本中肿瘤球体的活性、大小和边界识别，由SMART系统测量。(A) 在第1天添加药物。使用SMART系统在第1、3、5、7和10天测量肿瘤球体的活性和大小。细胞活性、球体大小、EPI（额外周长指数）和MSEI（多尺度熵指数）通过SMART系统进行分析。(B-C) 在不同天数记录了肿瘤球体的图像。

研究结论

基于人工智能的分析系统能够实现完全自动化的肿瘤球体侵袭分析，无需进行样本标记。该系统在提供与人类专家相当的三维肿瘤球体分析精度的同时，大幅降低了时间和劳力成本。我们开发的评估癌症侵袭性的指标，显著改进了三维环境中肿瘤球体侵袭性的定量评估。我们的研究提供了自动化工具，这将使得在高通量临床前药物筛选中应用更精确的三维体外肿瘤模型成为可能，从而加快新抗转移药物的发现进程。

艾玮得类器官及器官芯片智能分析系统

器官芯片智能分析系统以AI智能分析为核心，集结光学显微成像、智能传感器、可视化呈现等关键技术应用，为类器官识别、肿瘤球活性、肿瘤入侵性等检测项目打造“无限”3D智能成像分析平台。实现精湛成像、多层扫描、智能训练，优化科研学者的使用体验，满足用户对科研力、稳定性、智能一体化的多样化需求。

核心优势

强大的明场/相差/荧光成像能力

提供明场、相差和荧光三种成像模式，四组荧光滤色片镜组，支持DAPI、FITC、Texas Red、AlamarBlue荧光成像。

多层扫描智能算法

多层扫描智能算法与标记功能，轻松融合，使3D成像变得简单易行、一目了然。数据可视化呈现、保存并实时上传全流程追溯与分析软件系统云端，AI智能识别类器官，识别成功率不低于85%。

肿瘤球描边分析算法

兼容丰富多样的样本来源，包括肝脏、胰腺、结肠、肺、心肌细胞、毛细血管等组织器官的智能分析。强大的智能训练单元能够即时、快速地完成特征提取、执行人工智能训练进而完成类似特征样本。

易用的云端可视化数据平台

提供易用的数据检索编辑功能，以可视化方式呈现，并为数据共享与安全提供了云端接口--全流程追溯与分析软件系统。

参考文献：

Chen Z, Ma N, Sun X, Li Q, Zeng Y, Chen F, Sun S, Xu J, Zhang J, Ye H, Ge J, Zhang Z, Cui X, Leong K, Chen Y, Gu Z. Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition. Biomaterials.2021 May;272:120770. doi: 10.1016/j.biomaterials.2021.120770. Epub 2021 Mar 22. PMID: 33798957.