文献分享 | 器官芯片助力肺模型构建和环境毒理学研究

首先将培养好的人肺泡上皮细胞（HPAEpiC）接种到芯片的上腔室，之后将芯片倒置在下层腔室接种人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC），培养一段时间后，利用流体控制系统在上腔室注入空气取代上腔室中的培养基，在下腔室连续灌注培养基，以建立气体-液体界面（ALI）培养环境，培养若干天后，将巨噬细胞接种到HPAEpiC细胞表面，之后再动态培养24-48小时，构建好的肺芯片模型能够模拟体内的肺泡-毛细血管屏障结构（图1，图2A）。

在肺芯片中，光学成像和基于荧光的活/死细胞染色成像显示上下腔室的上皮细胞和内皮细胞均形成了连续的细胞层（图2B和C）。基于荧光共聚焦成像的三维重构也表明培养室中的细胞趋向于逐渐形成连续层，从而构建出完整的上皮和内皮层（图2D）。紧密连接蛋白（E-钙粘蛋白和VE-钙粘蛋白）的阳性表达以及气液培养过程中稳定的跨膜电阻(Teer)值均表明在芯片上构建了结构完整和生理功能完善的肺泡-毛细血管屏障（图2E和F）。同时肺芯片能够维持稳定超过两周。

图 1. 肺芯片系统。A：肺芯片设计和加工；B：流体控制系统；C：肺芯片和PS-NPs暴露示意图。

图2 肺模型构建和特征。A: 肺芯片构建时间线；B: 肺芯片明场成像；C: 死活细胞染色；D: 肺芯片荧光共聚焦成像3D重构图；E: 紧密连接蛋白免疫荧光；F：气液培养过程中肺模型TEER值变化。

通过测试肺芯片暴露于不同种类的代表性环境污染物中的表现，可以用于建立环境毒理学研究平台。本研究将构建的肺芯片模型暴露于不同种类（生物气溶胶、化学污染物和纳米颗粒）的环境污染物（脂多糖、铜纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化锌纳米颗粒、氧化铝纳米颗粒、香烟烟雾提取物）24h，通过死活细胞染色成像和细胞活性分析显示，在荧光图像中芯片中的活细胞数量显著减少，而死细胞数量增加（图3A），同时细胞活性显著降低（图3B）。同时通过检测TEER值和渗透系数值以及荧光标记的葡聚糖定量，结果均表明环境污染物破坏了模型的屏障功能（图3C&3D）。进一步通过分析肺损伤相关的炎症因子分泌、活性氧(ROS)生成、THP-1（人白血病单核细胞）细胞粘附、抗胰蛋白酶(AAT，COPD标志物)表达（图4），显示肺芯片可以从多个维度分析环境污染物对于呼吸系统健康的损害，如炎症因子释放、更多的单核细胞粘附血管内皮细胞层、ROS过量生成、AAT表达减少，证明作为一种稳定和可靠的模型，肺芯片系统可以用于不同环境污染物的毒理学研究。

在模型暴露于PS-NPs 24小时后，通过死活细胞双荧光染色分析，结果表明纳米塑料以剂量效应的方式引起人肺上皮细胞和人脐静脉内皮细胞的死亡（图5A），其中低剂量和中等剂量的PS-NPs(7.5和15μg/cm²)对细胞活力基本无影响，但30μg/cm²的PS-NPs显著抑制了细胞活力（图5B）。结合低剂量下TEER值增加，猜测这可能由于保护性应激反应。综合分析不同剂量下的TEER值和FITC-葡聚糖扩散，结果均表明PS-NPs能破坏肺泡-毛细血管屏障的结构完整性和屏障功能（图5C&5D）。

将单核细胞灌注到血管通道以研究肺芯片在PS-NPs刺激下引发的炎症介导的免疫反应，结果显示细胞因子（IL-6、MCP-1和TNF-α）的水平在不同剂量暴露下均呈现显著增长（图6A）。同样，在不同剂量组中均观察到大量的THP-1细胞粘附在内皮层上（图6B），表明在肺芯片中不同细胞之间存在相关交流。作为炎症进展中的重要信号分子，研究人员进一步检测了活性氧(ROS)的生成，由PS-NPs诱导ROS生成表现出剂量-效应关系。有趣的是，在较低剂量暴露下HUVEC细胞的荧光信号比HPAEpiC显著更弱，而在高剂量下两种细胞的ROS生成相当，这也证实了模型的屏障功能及细胞间存在相互作用。（图6C）。

为了评估PS-NPs与细胞的相互作用，研究人员通过流式细胞术测量了肺芯片中PS-NPs的摄取情况。实验结果显示，PS-NPs以剂量依赖的方式在人肺上皮细胞/巨噬细胞、人脐静脉内皮细胞和THP-1细胞中积累。其中，PS-NPs在上皮细胞的内化率远高于其他细胞类型，仅在高剂量下观察到THP-1细胞对PS-NPs的摄取量增加（图6D）。结果同时还表明，PS-NPs首先被人肺上皮细胞/巨噬细胞摄取，通过破坏肺泡-毛细血管屏障，随后进入血液系统影响其他器官。为了进一步确认PS-NPs对慢性阻塞性肺疾病(COPD)风险的影响，研究人员检测了抗胰蛋白酶(AAT)的表达。在芯片经PS-NPs处理后，观察到了AAT值以剂量依赖性方式显著降低（图6E）。

艾玮得单腔膜式芯片