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华龛生物
2023/11/17 15:19
阅读:53
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前言
Foreword
背景:
人多能干细胞(hPSC)研究已经在再生医学、疾病建模、药物筛选和发现以及基于干细胞的治疗方面取得了重大进展。
局限:
在相关临床应用中,需要大量hPSC,而稳定的大规模hPSC生产制备仍受到传统二维培养的限制:无法满足hPSC扩增需要的足够表面积,并因此产生了更高的耗材试剂成本和时间成本。
突破:
hPSC可以通过聚集体的形式进行悬浮培养,3D悬浮培养可以支持更高密度的hPSC生长,显著降低培养基使用量,适用于规模化hPSC放大培养的多种应用。
在hPSC悬浮培养过程中,聚集体的控制是非常重要的,特别是在早期聚集体的形成阶段。因此,产生许多大小可控的团聚体,且能形成均匀的混合效果,使细胞能稳定生长极其重要。
hPSC可在华龛生物的3D FloTrix® miniSPIN 生物反应器中均匀成团并稳定生长,细胞4天可增殖3倍以上,多能性相关指标SSEA4与OCT4阳性率可维持在90%以上,是理想的hPSC悬浮培养系统。
hPSC 培养案例
Cell Culture Cases
1. 培养方法
① 125mL转瓶准备
将125mL玻璃转瓶清洗干净,安装桨叶时尽量调整桨叶位置使其靠近转瓶底部,桨叶位置过高将导致细胞无法形成聚集体。
安装好后进行高压蒸汽灭菌、烘干备用。(若使用一次性转瓶则无需进行此步骤。)
② 细胞复苏
提前将完全培养基恢复至室温,复苏hPSC细胞,以5×105/mL的密度接种于125mL转瓶中,培养基为含ROCK抑制剂的(10μM Y27632)的mTeSR培养基。
将转瓶置于3D FloTrix® miniSPIN反应器上,70rpm避光培养过夜。培养体系30-65 mL。
③ 细胞换液
hPSC细胞悬浮培养需要每天进行半换液。将转瓶在超净工作台上静置5min,从液面靠上方吸取一半培养液到50 mL离心管中,适当吹打转瓶中的培养液防止聚集体融合。
将装有培养液的50 mL离心管离心,吸弃上清,加入等体积不含ROCK抑制剂的mTeSR培养基,将培养液转移到转瓶中。
将转瓶放到反应器上继续培养。注意操作过程中细胞聚集体不可静置超过15min,否则会促使聚集体发生融合。
④ 细胞传代
细胞培养4~5天,镜下观察细胞聚集体粒径在250-350μm范围时可进行传代操作,粒径不可超过400μm,否则会影响细胞干性。
使用Accutase消化液将细胞聚集体消化15min,单细胞进行传代,传代密度为5×105/mL,搅拌速度70rpm。
2. 培养效果
在3D FloTrix® miniSPIN反应器上,细胞成团均一,呈圆润球形。
随培养时间增加,聚集体粒径增加,培养4天粒径为222±37μm,细胞增殖3倍以上,细胞活率维持在90%以上。
同时,hPSC干性Marker SSEA4与OCT4双阳比率维持在95%以上,表明细胞在培养过程中维持良好的分化功能。
结论
Conclusion
使用3D FloTrix® miniSPIN反应器可以很好的进行hPSC细胞的悬浮培养,可应用于hPSC细胞的扩增、建库与分化。
结合反应器具备的多点控制功能,可用于hPSC细胞分化过程中的条件摸索,反应器配备的125mL培养瓶可通过高压灭菌重复使用,节省耗材设备成本,是理想的hPSC悬浮培养系统。
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培养瓶125mL/250mL/500mL,多种规格可选,可高压灭菌、重复使用。
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