牛血清在细胞培养中您知道有什么作用吗?

  标签：牛血清 蛋白酶抑制剂 古朵生物 培养基

  牛血清在细胞培养中您知道有什么作用吗?

  生物技术已经被各国视为一种高技术，在整个科学技术中占据了特殊的显著地位，特别是生命科学的发展geng离不生物技术，生命科学的发展备受各国的重视。我国在很多大学中都设立了生命科学院。现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养geng具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体;细胞工程中geng是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。细胞培养的发展，培养基的质量又是关键，而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清又是zui-为广泛的，所以牛血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。保证牛血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。

  一、 牛血清在细胞培养基中的主要功能牛血清是细胞培养中用量zui大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有为重要的功能。

  1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。

  2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。

  3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。

  4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。

  5.起酸碱度缓冲液作用。

  6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

  二、 牛血清的主要成份

  血清是一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生-理条件和营养条件不同而异。

  1.蛋白质是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。纤维粘连素 细胞促进细胞附着;α2 巨球蛋白 抑制胰蛋白酶的作用;胎牛血清中含胎球蛋白 促细胞附着;转铁蛋白 能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。

  2.多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子;成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。

  3.激素：激素对细胞的作用是多方面的。

  胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。

  类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。

  促生长激素：促细胞增殖效应。

  氢化-可的松：血清中含有定量的该成分，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用，但有人证明，血清中的氢化-可的松，如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。

  4其他成份

  氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意义。

  三、 牛血清的质量要求

  随着科学技术的发展和生活水平的不断提高对生物医药产品的质量要求也越来越高，所以对制备工艺中所涉及到的各种原材料的质量标准要求也越来越高，特别是对用于细胞培养基中的主要天然成份――牛血清的质量要求也不断提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。

  (一)、WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求：

  1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或。并应具备适当的监测系统。

  2.有些还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。

  3.证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。

  4.血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。

  5.无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些要求无细菌噬菌体污染。

  6.对细胞有良好的支持繁殖作用。

  (二)、我国在对牛血清的质量2000年版《生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。

  (三)、美国对牛血清的质量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美国牛血清供应商的牛血清都已进入到我国市场，他们对其质量标准要求都为严格，从血清来源到产品质量都有明确规定。

  1) 血清来源：可从各国收集胎牛血清，但是必须符合他的质量标准和美国农业部进口要求。地方当局还不清楚本地是否有牛海绵状病毒流行的血清不收集，有说明血清质量的证明资料：包括收集过程的全部资料、检验结果和交付情况。

  2)血清的收集：胎牛血清是心脏穿刺取血，新生牛(10～14天)和小牛(10个月内)血清静脉取血。血清采集条件必须符合工业生产的标准：低温下采集、一次分离、分离后立即混合冻存。符合要求的血清56℃水浴30分钟灭活。

  3)血清的制备：

  a. 超低IgG胎牛血清：通过亲和层析工艺去除胎牛血清中的γ球蛋白，使FBS γ球蛋白含量减到zui低，一般IgG≤5ug/ml，生物学活性不变。

  b. 血清透析：用12000～14000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量<0.5mg/ml(用葡萄糖氧化酶/过氧化酶方法测定)。

  c. γ-射线照射：已经证明γ-射线照射可以有效灭活血清中可能污染的病毒、支原体。照射剂量为30～45KG。而且这个剂量的γ-射线照射不会改变血清的理化性质和对细胞培养的影响。

  4)除菌过滤:经过上述处理的粗制血清再经过一系列除菌滤膜过滤包括0.2微米(micron)和0.1微米滤膜。FBS要通过三层0.1微米滤膜，其他血清可通过0.2微米滤膜。

  4.终产品血清质量

  1)化学检定：渗透压

  pH

  蛋白含量――电泳法

  白蛋白 球蛋白 血红蛋白随着牛年龄增加血清中总蛋白含量相应增加，总的血清蛋白含量可以确定产品规格和年龄。

  2) 微生物学检查：细菌、真菌符合USP标准。支原体：在支原体专业培养基上培养了3～4周，培养温度36℃±2℃分别在需氧和厌氧条件下进行，有的还需要在支原体琼脂培养皿上传4次，Hoechst荧光素DNA染色检查那些培养法无法检出的支原体如猪鼻支原体等。

  病毒检查：

  牛兰舌病毒 Bovin blue tongue

  牛腺病毒 Bovine Adenovirus

  牛细小病毒 Bovine Parvovirus

  牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus

  狂犬病病毒 Rabies

  呼肠弧病毒 Reovirus

  牛呼吸道合胞病毒 BRSV

  副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza

  检查方法：

  已证明无外源因子污染的牛细胞培养物，在细胞生长液中加15%待测血清，连传3代共21天。阴性对照细胞培养液中加15%已知无病毒污染的牛血清，与试验组同条件下进行。在观察期内注意细胞形态变化或细胞病变。在观察期内第14天待检样品和对照样品用标准病毒检测方法检查。

  如待检细胞培养物经胰酶消化后分种到6个含盖玻片的容器内。阴性对照样品按同样方法。再将牛腹泄病毒、牛细小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼肠弧病毒分别加入待检培养物盖玻片容器内作为阳性对照，再培养7天，用荧光抗体技术进行检查。

  细胞病变或病毒引起的其他改变通过苏木精或伊红染色进行观察。取另外一个待检细胞培养瓶用人“O”红细胞、豚鼠红细胞和新鲜鸡红细胞作血球吸附病毒检查。试验在2～8℃和20～24℃进行。阴性对照细胞预先感染副流感Ⅲ型病毒作为阳性对照。未感染的细胞作为阴性对照。

  3)内毒素检测

  用鲎试剂检查。

  4)细菌噬菌体检查

  主要检查E.Coli(C300 or K-12)噬菌体。

  5)激素含量测定

  每批FBS对某些激素含量都要进行测定，包括：雌二醇、胰岛素、孕硐、睾-丸素、甲状腺素等。

  6)血红蛋白检测

  血红蛋白与氧合血红蛋白的比≥70%，血红蛋白含量≤mg15/dl。

  7)细胞生长效果测定

  a.细胞克隆效果测定

  细胞选择：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653

  血清浓度与细胞数:

  10%血清/1个细胞/孔

  4%血清/5个细胞/孔

  细胞培养基RPMI-1640， 96孔培养盘36℃±2℃，5%二氧化碳培养10～15天。试验中选择一个已知参考牛血清作对照。

  克隆效率计算：

  克隆效率=(阳性孔平均数/ 培养孔总数) X100%

  相对克隆效率=待测血清克隆效率/参考血清克隆效率

  b.贴壁效率试验：

  用人的传代细胞作每批血清的贴壁效率试验，A549(人肺癌细胞)该细胞可以反应出低浓度血清的贴壁变化。采用6孔培养盘每批血清用两种浓度和两种不同的细胞接种数即10%血清――100细胞/孔，4%血清200介细胞/孔。放36℃±2℃，湿润5%二氧化碳培养箱培养10～14天，计算着色细胞克隆，确定贴壁效率。从这两种不同血清浓度来确立实验血清支持细胞贴壁生长的水平，分析两种试验条件下平均贴壁效率。贴壁效率(%)=(每孔克隆平均数/ 每孔活存的培养细胞平均数) X100%

  相对贴壁效率=被测血清贴壁效率/参考血清贴壁效率

  c. 二倍体纤维细胞促生长试验

  人二倍体细胞株 WI28 MRc5

  25cm2细胞培养瓶，5%血清，每瓶接种1.5X105细胞连传3代，每代血清浓度和接种细胞数相同，每代培养7天，每代接种二个细胞瓶，36℃±2℃培养。以同样条件用已知参考血清进行平行培养。每代收获细胞计数，计算每批待检血清与参考血清的相对生长率(RGR)。

  RGR=(试验血清每瓶细胞平均数/ 参考血清每瓶细胞平均数) X100%

  牛血清主要质量要求(Sigma)

  胎牛血清 新生牛血清 成牛血清

  牛龄 胎 10～14天 <10个月

  无菌 - - -

  病毒 - - -

  支原体 - - -

  噬菌体 - - -

  内毒素(ng/ml) ≤1.0 ≤10.0 ≤10(15)

  血红蛋白(g%) 3.0～4.5 3.5～6.0 5.0～8.5

  pH 6.7～8.0 7.0～8.0 7.0～8.0

  渗透压(mom/Kg H2O) 240～340 240～340 240～34

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