免疫荧光染色|七色多重荧光染色试剂盒技术原理

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　　免疫荧光染色|七色多重荧光染色试剂盒技术原理

　　免疫荧光染色|七色多重荧光染色试剂盒 (六标七色)

　　原理介绍:酪酰胺信号放大(TSA，Tyramidesignalamplification)技术是一类利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采用HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤(HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

　　TSA详细原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结

　　合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增强。简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP(而不是直接偶联荧光素)，来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。本公司开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种：480，520，570，620，690，780。此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。可以实现单标、双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能，极大丰富了此试剂盒的内涵。

　　试剂盒组成：

　　480荧光染料(即用型，5mL),-20℃;520荧光染料(绿光)(即用型，5mL),-20℃;570荧光染料(红光)(即用型，5mL)，-20℃;-620荧光染料(即用型，5mL)，-20℃;690荧光染料(即用型，5mL)，-20℃;780荧光染料(即用型，5mL)，-20℃;TSA+增强剂，100ul，-20℃(可选);

　　高敏多聚hrp山羊抗兔二抗(20mL)4℃。

　　备注：480荧光染料、520荧光染料、570荧光染料、620荧光染料、690荧光染料、780荧光染料在-20度下，均为固体，使用之前需解冻。

　　TSA+增强剂使用方法：TSA+增强剂能够进一步增强荧光信号放大液的放大信号5-10倍，TSA+增强剂：荧光放大液=1:500，使用TSA+增强剂不是必须的选项，可以根据具体的情况选择添加或者不选择添加。

　　操作流程：

　　1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ。取出放在通风厨内，酒精晾干后放入自来水中稍洗，蒸馏水洗。

　　2、抗原修复：组织切片置于盛满PH9.0EDTA碱性抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复(也可以用高压1-2min100度水煮15min95度水浴20min

　　免疫荧光染色|七色多重荧光染色试剂盒技术原理上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求”的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量”的方针。