谷氨酰胺(Glutamine)分光比色法试剂盒测定意义及原理

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　　谷氨酰胺(Glutamine)分光比色法试剂盒测定意义及原理

　　正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

　　测定意义：

　　谷氨酰胺(Glutamine)是构成人体蛋白质所必需的20种氨基酸之一。是人体内最普遍的、不可缺乏的条件性必需氨基酸，是构成蛋白质不可缺少的氨基酸之一，更是某些细胞培养中最基本的元素。由于谷氨酰胺不稳定的特性，在细胞培养基的整合中，易自发性分解为谷氨酸和氨离子，而氨离子对细胞的毒性很强，因此，在细胞培养体系中，须密切关注谷氨酰胺的储存寿命(SHELF LIFE)和实时监测。

　　测定原理：

　　在谷氨酰胺酶(Glutaminase)作用下，谷氨酰胺发生脱氨基反应，产生谷氨酸(glutamic acid)和氨离子;

　　谷氨酰胺+H2O———————谷氨酸+NH4+

　　然后用显色剂进行显色，显色后在570nm下进行测定。

　　需自备的仪器和用品：

　　可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。

　　试剂的组成和配制：

　　试剂一：液体50mL×2瓶，4℃保存;

　　试剂二：液体1.5ml×1瓶，-20℃保存;

　　试剂三，粉剂×1瓶， 4℃保存;临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀溶解，用不完的试剂仍 4℃保存

　　谷氨酰胺提取：

　　1、细菌或培养细胞样品：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个)：试剂一体积(mL)为500~1000：1的比例(建议1000万细菌或细胞加入2mL试剂一)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次);8000g 常温离心10min，取上清，置冰上待测。

　　2、组织样品：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例(建议称取约0.2g组织，加入2mL试剂一)，进行冰浴匀浆。8000g 常温离心10min，取上清，置冰上待测。

　　3、血清(浆)或细胞培养液样品：按照血清(浆)或细胞培养液体积(mL)：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例(建议取0.2mL血清(浆)或者细胞培养液加入2mL试剂一)，进行冰浴匀浆。8000g 常温离心10min，取上清，置冰上待测。

　　测定步骤

　　1、分光光度计预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。

　　2、在有盖EP管中加入下列试剂：试剂名称(μL)测定管对照管1对照管2

　　样本10001000

　　试剂一 1000

　　试剂二1010ul蒸馏水10

　　混匀，37℃水浴30min(盖紧，以防止水分散失)，试剂名称(μL)测定管对照管1对照管2

　　试剂三200200200

　　90℃水浴20min(盖紧，以防止水分散失)，流水冷却，于570nm波长处比色，

　　△A=A测定管-A对照管1 - A对照管2。对照管2只要做一管。

　　谷氨酰胺含量计算：

　　1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0074x-0.5255;x为谷氨酰胺含量(µg/mL)，y为吸光值。

　　2、按照血清(浆)或者细胞培养液体积计算

　　谷氨酰胺含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V3×V1÷V2)=1351×(△A+0.5255)

　　3、按照蛋白浓度计算

　　谷氨酰胺含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V1×Cpr)=135.1×(△A+0.5255) ÷Cpr

　　4、按照样本质量计算

　　谷氨酰胺含量(µg/g鲜重)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(W×V1÷V2)=270.2×(△A+0.5255) ÷W

　　5、按照细菌或细胞密度计算

　　谷氨酰胺含量(μg/104 cell)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(1000×V1÷V2)=0.27×(△A+0.5255)

　　V1：加入反应体系中样本体积，1mL;V2：加入提取液体积，2 mL;V3：加入血清(浆)或细胞培养液体积，0.2 mL; Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL;W：样本质量，g;1000：细菌或细胞总数，1000万。

　　注意：

　　1、该试剂盒仅适用于发酵液或组织中谷氨酰胺含量测定，检测下限为100µg/mL。

　　2、标准曲线线性范围为：100µg/mL -600µg/mL。

　　3、ΔA线性范围为：0.01-2;若大于2则需要将上清液用试剂一稀释至适当倍数后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数。

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