【预约试拍】随机光学重建显微镜STORM显示的内皮细胞表面糖萼（ESG）成分和超微结构

为了在血管功能中作为血流的机械传感器和作为经血管交换的屏障发挥不同的作用，内皮表面糖萼（ESG）应该具有有组织的结构。由于光学显微镜和电子显微镜的局限性，直到最近发展的超分辨光学显微镜STORM才揭示了ESG的超微结构。

实验结果表明：HA是一种长链分子，编织成网状覆盖在内皮细胞表面.相比之下，HS是垂直于细胞表面的较短分子。HA和HS在内皮管腔表面彼此部分重叠。研究者还定量了内皮表面顶部、中部和底部区域的HS的长度、直径、方向和密度。

一 导言

排列在我们血管系统中的内皮细胞（EC）的腔表面包被有由蛋白聚糖和糖胺聚糖（GAG）组成的膜结合大分子的糖萼。由于其独特的位置，在循环血液和血管壁的界面处，已经发现ESG在维持正常血管功能方面起重要作用。因此，自20世纪60年代以来，通过各种方法对其组成、结构和机械性能进行了广泛的研究。然而，由于空间分辨率的限制或样品制备过程中的人为因素，静电陀螺仪的空间化学组织仍然不清楚。

最近开发的随机光学重建显微镜（STORM）是三种类型的单分子定位显微镜之一，采用有机染料和荧光蛋白作为光可切换发射器，以将时间分辨率转换为超空间分辨率，这比传统的共聚焦显微镜高一个数量级。STORM和其他类型的超分辨率光学显微镜能够在纳米尺度上发现和研究细胞结构，从单个蛋白质到天然细胞环境中的整个细胞器。

ESG的作用基于其分子组成和组织。ESG的组成部分已在中进行了深入研究。ESG主要由带有短酸性寡糖和末端唾液酸（SA）的糖蛋白和蛋白聚糖（PG）如硫酸乙酰肝素PG（HSPG）（包括具有长糖胺聚糖（GAG）侧链的多配体聚糖和磷脂酰肌醇聚糖核心蛋白）组成。带负电荷的GAG结合蛋白质、生长因子、阳离子和其他血浆组分。血管EC中的主要GAG是硫酸乙酰肝素（HS）、硫酸软骨素（CS）和透明质酸（HA）。在这三者中，最丰富的是HS，占总GAG的50-90%，其余由CS、HA和SA组成。HS和CS与PG共价结合，而HA不与PG核心蛋白结合。HA是一种非硫酸化GAG，其与其表面受体CD 44和HA介导的运动性受体（RHAMM）结合。

除了其生化组成外，ESG的厚度和超微结构决定了其功能。通过电子显微镜（EM）对ESG的第一次可视化使用阳离子染料钌红，其结合酸性粘多糖并在四氧化锇存在下产生电子密度。随后的研究使用金胶体和免疫过氧化物酶标记。Adamson和Clough然后使用大的带电标记蛋白（无法穿透ESG），阳离子化铁蛋白（分子量≈ 450 kDa）证明，在不存在血浆蛋白的情况下，ESG会崩溃，可能是由于消除了与血浆蛋白的分子内相互作用，并且其未受干扰的厚度比钌红观察到的20 nm大几倍。所有这些方法都可能遭受与水性固定剂相关的脱水假象，水性固定剂可能溶解除蛋白聚糖的蛋白质核心之外的所有蛋白质，并破坏固有的水合结构。研究人员开发了一种使用碳氟化合物作为四氧化锇的非水载体来保存水溶性结构的方法，该方法被应用于微血管，以消除其中的一些限制。Rostgaard和Qvortrup对碳氟化合物-戊二醛固定方法的进一步阐述揭示了毛细血管壁上的丝状刷状表面涂层，但层厚度小于50 nm，表明更表面的基质结构裂解。所有前述EM研究揭示具有小于IOOnm的厚度的ESG。最近研究者发现大鼠左心室心肌毛细血管上的ESG厚度为0.2-0.5 μm。

ESG的超微结构组织及其与细胞骨架组分的关系（使用电子断层扫描进行3D重建得到证实。通过他们的EM方法观察到的ESG的厚度为〜 100nm，类似于先前在青蛙肠系膜微血管上发现的厚度。

克服脱水工件在新兴市场和传统荧光显微镜的空间分辨率的限制,在目前的研究中,通过使用STORM,研究者发现第一次超限分辨图像ofHS和HA组件的环境、社会和治理在支架表面培养bEnd3老鼠大脑微血管内皮细胞单层,并量化ultra-structural参数ofHS和直径HA在EC支架表面的不同区域。

二 实验方法

细胞培养：小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd 3），来自ATCC（Manassas，VA）在Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12 Ham培养基中培养。（DMEM/F-12）、2 mM L-谷氨酰胺和100 U/mL青霉素和1 mg/mL链霉素（均来自Sigma-Aldrich，St. Louis，MO），补充有10%胎牛血清，并在37 °C下在具有5%C02的潮湿气氛中孵育。

免疫荧光染色：将bEnd 3细胞胰蛋白酶化并以600个细胞/mm 2的密度接种在50 yg/mL纤连蛋白包被的1.5号玻璃底培养皿上并培养3-4天直至汇合。然后用1%BSA/PBS轻轻洗涤细胞，用2%多聚甲醛和0.1%戊二醛固定20分钟，用0.1%NaBH4还原7分钟，用1%BSA/PBS洗涤3次，并用2%正常山羊血清（NGS）封闭30分钟。对于HS染色，将固定的细胞与小鼠抗硫酸乙酰肝素10 e4在4 ℃孵育过夜，然后与ATTO 488缀合的山羊抗小鼠IgG孵育;对于HA染色，将固定的细胞与生物素化的透明质酸结合蛋白在4 °C孵育过夜，然后与Alexa Fluor 647缀合的抗生素孵育。最后，将样品用2%多聚甲醛和0.1%戊二醛后固定10分钟，然后保持在1%BSA/PBS中。

应用单发射器质心算法来估计数据电影中激活的荧光团的3D位置，并产生3D STORM图像，其空间分辨率分别为侧向平面中的20nm和轴向方向上的50nm。通过使用混合高斯模型从STORM图像估计细胞表面上的组分中的地面实况荧光团位置。然后，在估计的荧光团位置的基础上估计组件的超微结构参数。对于HS元件，我们假设它是一个圆柱体，其等效直径具有与真实的形状相同的横截面积（椭圆状）。其他超微结构参数、长度、HS的取向和相邻HS元件之间的距离（中心到中心）在图2的插图中定义。由于难以识别在细胞腔表面处编织成网络的单个HA元件，我们从图3中所示的HA区段的2D图像估计HA直径。

三.研究结果

图1A-C展示了STORM揭示的HS和HA的组织。图1A是在顶部区域观察到的，图1B是在中间区域观察到的，图1C是在细胞腔（顶端）表面的底部区域观察到的。对于所有图，第二列是HS图像（绿色），第三列是HA图像（红色），第一列是第二列和第三列的叠加。第一行是2D顶视图，第二行是34 μm × 34 μm视场的3D视图。第三和第四行是第一行中具有绿色虚线的区域的放大的2D和3D视图。第五和第六行是来自第三行中具有蓝色虚线的区域的进一步放大的2D和3D视图。第二列和第三列中三维视图左侧的颜色条表示长度比例。从这些图中可以看出，HA（红色）是编织成2D网络片的长分子，其覆盖细胞腔表面并且与细胞腔表面在同一平面中。相比之下，HS是垂直于细胞腔表面的较短分子。HS和HA在细胞腔表面部分重叠。

图1 STORM揭示的ESG成分和超微结构

表1 bEnd3细胞腔表面HS超微结构的定量

表2 在bEnd3细胞腔表面的HA直径

表2总结了HA直径估计从2 d图像图3所示。直径是185.3±44.7 nm, 155.5±57.2 nm,和156.9±56.1 nm,分别在顶部、中部和底部区域的细胞腔的表面。这在HA直径没有显著差异这三个地区(p > 0.1)。比较HA直径与HS直径没有区别哈哈直径和HS直径顶部和底部区域(p > 0.2),但在中部地区有显著差异(p < 0.01)。

四.讨论

使用STORM，研究者揭示了在纳米尺度的bEnd 3单层的ESG中HS和HA的空间化学组织。直接和间接证据表明，ESG在维持血管功能方面至少发挥三种重要作用。

1)它可以作为EC的机械传感器和换能器来感知血流；

2）它通过形成分子筛维持正常的微血管通透性，允许水和小分子通过但限制血浆蛋白等大分子;

3）它在循环红细胞（RBC）和形成血管壁的EC之间产生润滑缓冲液以避免RBC损伤，并产生屏障以防止循环白细胞、血小板和肿瘤细胞粘附到血管壁。它还屏蔽EC表面受体，防止其超活化。

STORM揭示的ESG中HS和HA的组织和分布为ESG扮演这三个角色提供了直接的结构可行性。HS元件垂直于细胞腔表面，能够感测血流并用作EC的机械传感器和换能器。在细胞腔表面的底部处的更密集的HS分布（其可以覆盖细胞间连接）沿着由HA形成的编织网络有利于ESG成为用于经血管交换的分子筛、循环细胞和形成血管壁的内皮细胞粘附的屏障以及EC表面受体的屏障。

总之，ESG在bEnd3细胞表面的空间化学组织被揭示，从STORM采集的图像中还获得了HS的超微结构参数和HA的直径。

在本研究中，研究者主要借助STORM超分辨率显微镜来研究巨噬细胞足体簇的纳米结构和调控，目前在国内，随机光学重建显微镜STORM已成功实现商用，有需要STORM成像技术进行实验研究的专家老师们，请文末填写问卷，即可预约获得 iSTORM 超高分辨率显微成像系统试拍服务~

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