【文献解读】随机光学重建显微镜助力线粒体动力学的STORM成像（申请试拍）

随机光学重建显微镜（STORM）可应用于超微线粒体结构的可视化。本文作者开发了一种新的策略来捕获线粒体动态使用压缩传感STORM算法以下的原始数据预处理的噪声校正的主成分分析和K因子图像分解。使用STORM显微镜与邻近二硫醇蛋白质靶向探针，可视化线粒体动力学是可实现的空间和时间分辨率为45 nm和0.8 s，值得注意的是，动态线粒体微管收缩〜 746 nm在1.2 s的监测。标记的缀合物被观察为分布在线粒体外膜上的簇（半径，~90 nm），据我们所知尚未报道。这种策略是有前途的定量分析细胞内的行为低于光学衍射极限。

荧光显微镜被广泛用于研究活细胞中的单个线粒体。然而，使用常规光学显微镜成像线粒体亚结构受到光学衍射极限的限制。由于超分辨率成像的出现，使超细结构可视化已成为可能。

在这项工作中，研究者进行了STORM成像的活细胞中的线粒体动力学，并进行了定量分析的目标下STORM超分辨率显微镜。一种新的荧光标记适合于STORM成像的开发选择性地标记VDPs的外线粒体膜上的简单的共培养与细胞。同时，研究者采用了一个温和的照明激光功率，以获得尽可能多的单帧发射极定位，并减少光漂白和光毒性。STORM成像的时间分辨率可以通过降低激光功率和提高CCD帧频来实现。为了避免背景噪声的干扰，噪声校正的主成分分析（NC-PCA）和K因子图像分解的组合被开发来处理原始数据之前，使用CSSTORM算法重建。使用这种策略，研究者实现了线粒体动力学的STORM成像，包括融合，分裂和线粒体微管化。此外，在STORM成像下，通过层次聚类分析定量评估线粒体外膜上的VDP分布。

Cy 5荧光染料是STORM显微镜的理想的光闪烁候选者，并且1，3，2-二硫砷杂环戊烷是用于VDPs共价结合的有用单元。哌嗪间隔基用作连接基（图1A）。根据先前描述的方案16制备荧光探针1。在将其应用于细胞成像之前，研究了1的光谱性质。首先，乙醇中的探针1在649 nm处显示最大吸收，摩尔消光系数为2。1 ± 0.3 × 105和670 nm处的发射最大值（图1B）。还在水溶液中检测了相同的参数，获得了相似的结果。与罗丹明B相比，在乙醇中获得0.28的荧光量子产率，在水溶液中获得0.18的荧光量子产率。此外，使用自制的dSTORM系统研究了1的单个分子的光闪烁行为。在不存在成像缓冲液和硫醇7，17的情况下，将1的样品直接用激光束（656 nm，0.8kW·cm 2）照射，以显示具有高光子数（约100 nm）的显著的光闪烁荧光。3000个光子/像素）和低的开关占空比（约0.001）。0.0013）。在合适的开关频率下，光闪烁的持续时间持续超过900秒，而“开启”状态的平均光闪烁周期约为88.2ms（图1C-F）。

图1. 目标化合物1在没有成像缓冲液的情况下的化学结构和光学性质

为了进一步验证在CSSTORM定位之前通过NC-PCA+ K因子处理的去噪，我们将通过CSSTORM获得的重建结果与单分子拟合（insight 3软件）算法的重建结果进行了比较，如图2所示，使用具有从公开可用的EPFL网站18获得的高密度标记STORM数据的微管蛋白。首先使用NC-PCA算法对数据集进行去噪，然后使用K因子算法进行锐化。通过CSSTORM（图2A（a-c）和单分子拟合（图2A（d））获得了微管蛋白的类似结构，并且CSSTORM仅使用500个相机帧，甚至少至200个帧就表现出更大的结构连续性;然而，在CSSTORM（图2A（例如，i-k，m-o））和insight 3算法（图2A（h，l，p））之间的比较中，当使用100帧时观察到差的连续性。图2A（a-d）中的放大视图示出了在使用NC-PCA+ K因子算法去噪时明显锐化的结构（图2A（g）），其保持了与insight 3结果的最大结构一致性（图2A（h））。在NC-PCA+ K因子处理后，七个微管是可区分的，并且在原始数据的CSSTORM处理中或仅对于K因子处理，在相邻微管之间不可避免地出现模糊的噪声峰，如图2B（a-b）中的虚线圆所示。傅立叶环相关（FRC）是一种定量成像分辨率测量工具，已用于进一步评估图像分辨率的改善。

图2. 使用具有高密度标记的微管蛋白的实验数据集（来自EPFL）验证NC-PCA去噪算法

在用PBS、PBS-乙醇或乙醇溶剂洗涤后，探针不能从线粒体中除去（图S2 B、S2 C、S2 D、S5和S6）。此外，探针在我们的实验条件下未显示细胞毒性（图S7），这有利于活细胞超分辨率成像（图3）。

图3. 超分辨率成像探针1的线粒体膜贴上住海拉细胞固定海拉细胞(A)和(B)

为了确定1在活细胞线粒体中的确切位置，进行STORM超分辨率成像以确定由1标记的线粒体的超细结构。将探针1（1 μM）与HeLa细胞一起孵育1小时，无需进一步处理，重要的是，该程序比使用Alexa647的程序更简单。随后，在成像之前用戊二醛固定细胞样品或通过STORM系统用于活细胞成像。如图3A（a）所示，与不能提供线粒体的精细结构的宽视场图像不同，超分辨率图像显示了详细结构，其在活HeLa细胞（图3A（c））或固定细胞（图3B）中使用200帧通过CSSTORM（图3A（b））和去噪CSSTORM重建。从图3A（c）中的虚线方块所示的感兴趣区域的放大图像，去噪的CSSTORM分辨率明显高于CSSTORM的分辨率（图3A（d）），并且在图3A（e）中清楚地观察到线粒体膜上的离散颗粒分布，表明探针1选择性地标记线粒体膜上的VDP。通过高斯拟合计算CSSTORM和去噪CSSTORM的成像分辨率，示出108.7和45的半高全宽（FWHM）。如图3A（f，g）中所示。使用固定的HeLa细胞，STORM进一步支持1与线粒体膜上的VDPs的共价结合。当HeLa细胞与1孵育，用戊二醛固定并用PBS洗涤时，通过去噪CSSTORM算法获得线粒体的类似超分辨率图像（图3B（a，c，d）），并且高成像分辨率（图3B（e）中的30.2nm）使得能够研究线粒体外膜上的VDP分布以及它们的动力学。

STORM进一步应用于评估动态线粒体变化，包括线粒体融合、分裂和微管化。通过CSSTORM或去噪CSSTORM算法使用200个相机帧以20帧的步长进行重建以获得0.8s的时间分辨率来获得演示动态的视频。视频结果清楚地显示，与宽视场图像（图4A）和CSSTORM图像（图4 B）相比，去噪CSSTORM图像的分辨率明显更好。在通过NC-PCA+ K因子方法预处理后，去噪CSSTORM分析显示出明显的噪声抑制，并且实现了线粒体膜上的VDP的超细成像（图4C、）。此外，可以观察到线粒体的典型动力学以量化线粒体融合、分裂和成管的速度，这可能反映了生物活动中的线粒体状态20、21。捕获单个线粒体微管化和微管拉伸（图4C中的虚线正方形），并且不同的时间点显示在图4D中（1-6）。在管收缩期间的距离为~746 nm，并且在1.2s内完成（图4 E）。如通过高斯拟合计算的，中空管直径（图4F中放大的虚线圆）为51.8nm，并且膜宽度的FWHM值为46.9nm和43.5nm（图4G），与先前报道的结果22相当。

图4. 基于超分辨率成像的线粒体微管化分析

研究VDPs在线粒体膜上的分布可以提供对生物学功能的深入了解。我们使用开源软件Localization Microscopy Analyzer（LAMA）23基于基于密度的分层聚类算法来分析VDP的形态簇，即一个基于密度的算法发现集群在大型空间数据库中的噪声（DBSCAN）和排序点，以确定聚类结构（OPTICS）。考虑到压缩感测算法的像素化而不直接返回分子坐标列表，通过识别非零网格点的簇，首先将CSSTORM结果转换为分子列表作为LAMA的输入。选择感兴趣的区域（128×128像素的超分辨率网格图像）用于蛋白质聚类分析（图5A）。观察半径设定为19 nm，在DBSCAN中最小簇尺寸设定为6，并且在OPTICS 24中噪声水平设定为13.1%。总共，分别通过DBSCAN和OPTICS检测到32个和36个簇，并且在图5（B，E）中示出为簇群的2D分布。使用DBSCAN或OPTICS的结果进行基于DBSCAN的层次聚类分析，以通过多边形形成来提取单个簇的形态信息。具有16个假色的形态聚类分析结果总结在图5（C，F）中。最后，一个集群人口分布与集群大小约。如图5（D、G）所示，获得了90 nm，表明这是分析活细胞中蛋白分布的一种有前景的策略。

图5. 使用DBSCAN（B，C，D）和OPTICS（E，F，G）通过蛋白质聚类分析确定线粒体膜VDPs的分布

在该方法中，应用新的STORM探针共价结合线粒体外膜中的VDPs，这实现了STORM超分辨率成像，而不需要成像缓冲液和硫醇。使用由NC-PCA+ K因子预处理组成的噪声校正方法通过CSSTORM成像获得线粒体动力学分析。去噪CSSTORM能够实现线粒体的超细结构成像，在固定细胞中的空间分辨率高达30.2 nm，在活细胞中为45.7，时间分辨率为0.8 s。利用线粒体膜上1-VDP复合物的动态变化来显示线粒体动力学，包括融合、分裂和微管化，特别是ca.746 nm（1.2 s）。将线粒体外膜上的VDPs分布进一步分析为蛋白质聚集（约100%）。90 nm），以更深入地了解其生物学功能。新开发的策略将是有用的线粒体功能的进一步研究。

在本研究中，研究者主要借助STORM超助力线粒体动力学的STORM成像，目前在国内，随机光学重建显微镜STORM已成功实现商用，有需要STORM成像技术进行实验研究的专家老师们，请文末填写问卷，即可预约获得 iSTORM 超高分辨率显微成像系统试拍服务~

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